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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 原核表达His纯化仍有杂蛋白
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shuiniu87987

银虫 (小有名气)

[交流] 原核表达His纯化仍有杂蛋白 已有5人参与

分别用10mM咪唑，20mM 和40mM咪唑洗脱，目的蛋白在80mM咪唑洗脱下来，但是目的蛋白下面是杂蛋白还是降解的蛋白？如何判断？多谢。

原核表达His纯化仍有杂蛋白
gal蛋白2截图.png
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1楼 2014-06-27 12:06:31
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D_sheldon

银虫 (小有名气)
★
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一般刚洗脱出来的蛋白没有那么快就降解了的，个人觉得是杂蛋白呢。没有用比80mM高的浓度洗脱吗，我也纯化过HIS标签的蛋白是在80mM 100mM 150 200mM 都能洗脱下来带呢。所以建议你用更高浓度的洗脱 看是否能得到较单一的目的条带 而几乎没有杂蛋白。
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如果要让我活让我骄傲的活
2楼2014-06-27 14:11:57
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shuiniu87987

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by D_sheldon at 2014-06-27 14:11:57
一般刚洗脱出来的蛋白没有那么快就降解了的，个人觉得是杂蛋白呢。没有用比80mM高的浓度洗脱吗，我也纯化过HIS标签的蛋白是在80mM 100mM 150 200mM 都能洗脱下来带呢。所以建议你用更高浓度的洗脱 看是否能得到较单 ...

80mM就把目的蛋白洗下来了。用过150mM，基本上什么都没有，应该是80mM的把蛋白都洗下来了吧
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3楼2014-06-27 14:25:46
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shuiniu87987

银虫 (小有名气)
现在感觉降解的可能性大
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4楼2014-06-28 16:05:06
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)
★
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降解没降解这个不好讲，但是假如这里面是杂蛋白的话，可以用下面方法来优化
用大量的40mM咪唑（比如8-10倍柱体积）尽可能多地洗下来杂蛋白，然后直接换成250mM之类的高浓度咪唑洗脱目的蛋白下来，就别用梯度洗脱了。之前的binding buffer里面也按说明书加上5-10mM的咪唑（好像有人最高加到20mM）也可以一定程度上减少这个问题.
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5楼2014-07-01 09:20:18
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salanero2000

新虫 (初入文坛)
★
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即使容易降解，一般也有一个过程，请问从纯化收峰到电泳中间大概多久？
顺便问问有条件是否可以把破碎后、纯化前的样品电泳一下，做个对照？
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6楼2014-08-07 10:12:05
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嗨_跟我走吧

新虫 (初入文坛)
★
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最近用了别人送的海狸磁珠提取HIS标签目的蛋白试用试剂盒，还不错，有一两条杂蛋白，但是条带很弱，你可以试一试，而且时间2小时左右皆可以完成
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7楼2014-08-26 10:57:12
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91candy

铁虫 (小有名气)
★
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我想问问在诱导的电泳道中，条带为什么是这样的？这是表达的蛋白多吗？还是这个大小的蛋白种类多？
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8楼2015-05-04 15:38:48
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