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原核表达His纯化仍有杂蛋白
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shuiniu87987
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原核表达His纯化仍有杂蛋白
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分别用10mM咪唑,20mM 和40mM咪唑洗脱,目的蛋白在80mM咪唑洗脱下来,但是目的蛋白下面是杂蛋白还是降解的蛋白?如何判断?多谢。
gal蛋白2截图.png
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1楼
2014-06-27 12:06:31
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shuiniu87987
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现在感觉降解的可能性大
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2014-06-28 16:05:06
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D_sheldon
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一般刚洗脱出来的蛋白没有那么快就降解了的,个人觉得是杂蛋白呢。没有用比80mM高的浓度洗脱吗,我也纯化过HIS标签的蛋白是在80mM 100mM 150 200mM 都能洗脱下来带呢。所以建议你用更高浓度的洗脱 看是否能得到较单一的目的条带 而几乎没有杂蛋白。
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如果要让我活让我骄傲的活
2楼
2014-06-27 14:11:57
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shuiniu87987
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2楼
:
Originally posted by
D_sheldon
at 2014-06-27 14:11:57
一般刚洗脱出来的蛋白没有那么快就降解了的,个人觉得是杂蛋白呢。没有用比80mM高的浓度洗脱吗,我也纯化过HIS标签的蛋白是在80mM 100mM 150 200mM 都能洗脱下来带呢。所以建议你用更高浓度的洗脱 看是否能得到较单 ...
80mM就把目的蛋白洗下来了。用过150mM,基本上什么都没有,应该是80mM的把蛋白都洗下来了吧
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3楼
2014-06-27 14:25:46
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降解没降解这个不好讲,但是假如这里面是杂蛋白的话,可以用下面方法来优化
用大量的40mM咪唑(比如8-10倍柱体积)尽可能多地洗下来杂蛋白,然后直接换成250mM之类的高浓度咪唑洗脱目的蛋白下来,就别用梯度洗脱了。之前的binding buffer里面也按说明书加上5-10mM的咪唑(好像有人最高加到20mM)也可以一定程度上减少这个问题.
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5楼
2014-07-01 09:20:18
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