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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 片段回收后连接效率低下
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成功源于想像

铜虫 (小有名气)

[求助] 片段回收后连接效率低下 已有1人参与

片段割胶回收后用于连接，效率总是比直接纯化后连接低，这是什么原因呢？怎么解决这个问题呢？
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1楼 2014-06-26 19:52:42
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
成功源于想像(kx444555代发): 金币+2, 鼓励交流 2014-06-26 22:31:25
胶回收的效率向来很低，你可以少用点PCR产物电泳检测，然后直接回收PCR产物中的DNA，用天根的试剂盒就行。
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
2楼2014-06-26 21:41:17
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393658000

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-06-27 13:49:42
割胶回收的效率肯定比直接的PCR产物回收的效率姚笛，所以 你整体效率低的原因不是你说的那么回事 实际上是你割胶回收以后的量比你直接用PCR产物回收的量要低
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3楼2014-06-27 08:43:37
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-06-27 13:49:47
多切一点产物回收，量就大点。这样就好连接。
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4楼2014-06-27 11:23:36
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952038213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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成功源于想像(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 20:52:08
1割胶回收量低，跑电泳时加大上样量。
2用快速连接酶，不要用过夜连接的，快速的多连一会，我是3000连到10000的上面，长出来克隆少，但有就足够了，大片段本来就不好连。

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5楼2014-06-27 13:52:09
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成功源于想像

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-06-26 21:41:17
胶回收的效率向来很低，你可以少用点PCR产物电泳检测，然后直接回收PCR产物中的DNA，用天根的试剂盒就行。

1）因为有杂带，才做胶回收。
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6楼2014-06-30 20:54:59
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成功源于想像

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 393658000 at 2014-06-27 08:43:37
割胶回收的效率肯定比直接的PCR产物回收的效率姚笛，所以 你整体效率低的原因不是你说的那么回事 实际上是你割胶回收以后的量比你直接用PCR产物回收的量要低

1）因为有杂带，才做胶回收，要是没有杂带肯定直接纯化；
2）回收之后有测浓度，确实低很多，但是即使在相同浓度下，连接效率还是低很多，这是为什么呢？
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7楼2014-06-30 20:56:00
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成功源于想像

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 952038213 at 2014-06-27 13:52:09
1割胶回收量低，跑电泳时加大上样量。
2用快速连接酶，不要用过夜连接的，快速的多连一会，我是3000连到10000的上面，长出来克隆少，但有就足够了，大片段本来就不好连。
...

1）量不是问题；
2）这个建议不错，哪家的快速连接酶好呢？
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8楼2014-06-30 20:57:37
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952038213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 成功源于想像 at 2014-06-30 20:57:37
1）量不是问题；
2）这个建议不错，哪家的快速连接酶好呢？...

NEB的快速连接酶。

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9楼2014-06-30 21:32:33
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952038213

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 成功源于想像 at 2014-06-30 20:57:37
1）量不是问题；
2）这个建议不错，哪家的快速连接酶好呢？...

NEB的快速连接酶。

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10楼2014-06-30 21:39:04
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