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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 提取大肠杆菌质粒
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649436583

铜虫 (初入文坛)

[求助] 提取大肠杆菌质粒已有2人参与

首先我从高中毕业后再没接触过生物，对什么质粒、大肠杆菌是什么怎么做完全不清楚，公司老板分配给我的任务是用天根小提中量试剂盒提取大肠杆菌质粒，我全是从网上找的方法，希望各位大神帮帮忙我应该注意些什么，怎么操作。。。
先是配制LB培养基然后加氨苄青霉素，公司买的是生工的菌液加进去，昨天下午3点在摇床上开始震荡，接下来收集细菌和以下的步骤完全看不懂了，希望大神们通俗讲解一下。考虑到明后两天是周末，如果周一再做的话，今天需要怎么处理
拜谢各位
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1楼2014-06-20 10:00:20
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
649436583(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-20 10:27:34
(一)细菌的收获和裂解

1.收获

1)将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好(不盖紧)的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。

2)将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。

3)吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

2.碱裂解法

1)将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

溶液I

50mmol/L葡萄糖

25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)

10mmol/LEDTA(pH8.0)

溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
2楼2014-06-20 10:12:03
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649436583

铜虫 (初入文坛)
3楼2014-06-20 11:51:12
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大懒猫很懒

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然是试剂盒提取那就更简单了。  试剂盒里有说明书，你按照说明书来吧。
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4楼2014-06-20 15:30:31
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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649436583(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-20 16:41:21
昨天下午摇菌的啊，现在已经提了吧。

1.摇菌。
2.用2mlEP管收集菌液，12000g离心1min。弃上清，加溶液一。
3.涡旋混匀，不要有菌块。加溶液二，轻轻上下混匀8次左右。
3.加溶液三轻轻上下混匀8次左右。
4.12000g离心10min。
5.将上清过柱子，12000g离心30s。
6.加W1洗一次，加W2洗二次。
7.空离心，12000g离心1min。
8.加65度预热的Euent30ul溶解。
9.电泳检测浓度。

各试剂盒步骤应该大体差不多，所加溶液多少可能会有区别，请参照说明书。
纯个人操作方法，纯手打。
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5楼2014-06-20 16:04:50
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