| 查看: 3421 | 回复: 16 | ||
[求助]
大肠杆菌培养 质粒提取后困惑 已有8人参与
|
|
最近老师要求做 实时荧光定量PCR的细菌16S rRNA基因全长的标品。老师说，用质粒克隆的方法制备这样的标品。具体操作如下： 1.JM109 16s RNA基因全长的扩增（27f-1492r) 2.切胶纯化回收 3.目的基因与载体（PMD 19-T vector）的连接：10ul，4℃，过夜。 4.将连接有目的基因的载体转化至感受态细胞 DH5α：50ul感受态细胞与10ul以上溶液（第3步的）混合，冰上30min，42℃ 45s，冰上1min，加440ul SOC培养基37℃，180rpm，培养1h。 5.涂布：配制LB培养基，灭菌稍冷却后，添加1/1000的Amp，倒平板制成固体培养基。混合30ul x-gal、7ul IPTG和63ul ddH2O，加至固体平板上，涂布均匀。 取10u l第4步培养液，混合90ul灭菌dd H2O,相当于稀释10倍后，加至固体平板上，涂布均匀。 6.培养：倒置平板，待平板上的冷凝水晾干后，置于37℃，静置培养过夜。 7.蓝白斑筛选，培养：取出培养基，挑取白斑至3-4ml LB液体培养基（灭菌冷却后加1/1000Amp）中，37℃，180rpm，几个小时后，转移至100ml LB液体培养基中（灭菌冷却后加1/1000Amp）。37℃，180rpm，16h。 8.质粒提取：取第7步培养后的菌液5ml，离心，弃上清。步骤按照TIANGEN质粒提取试剂盒。 问题就卡在了质粒提取后，出现3个条带，如图跑得最快的两条最亮。问过同实验室的师兄师姐，他们说未遇到过这种情况，他们提出来的质粒都是两条，一条是不亮的基因组DNA，一条是亮的质粒。我不知道我的是怎么回事，质粒提取操作重复两次，仍是一样的结果。求解。  E.coli 质粒的提取.png |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有234人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 金葡，大肠，乳杆菌
已经有3人回复
- 求助~~~~大肠杆菌内质粒会不会自行发生同源重组？
已经有11人回复
- 大肠杆菌三个质粒共转化问题
已经有3人回复
- 求助大肠杆菌发酵问题
已经有15人回复
- 摇的转化到大肠杆菌的质粒有沉淀
已经有20人回复
- 目的片段+pPIC9K载体转化大肠杆菌DH5a后提取质粒失败
已经有13人回复
- 克隆提取质粒测序结果怎么跟大肠杆菌菌液测序结果序列比对差异很大啊？
已经有4人回复
- 质粒导入大肠杆菌导不进去，求高手指点
已经有16人回复
- 大肠杆菌CaCl2法转染质粒DNA需要注意哪些方面？
已经有7人回复
- 本来带有质粒的大肠杆菌再对它进行一次质粒转化能达到增加质粒拷贝数的目的吗？
已经有10人回复
- 含AMP时培养大肠杆菌的问题
已经有5人回复
- 有木有大肠杆菌单拷贝的表达质粒？
已经有3人回复
- 谁有用于大肠杆菌基因敲除的pKD46、pCP20等质粒
已经有7人回复
- 质粒导入大肠杆菌
已经有9人回复
- 【求助/交流】含质粒pSUP202的大肠杆菌S17-1抗生素加多少啊？
已经有6人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌转化质粒，出来的不是我要的了，怎么回事？
已经有13人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母质粒转化大肠杆菌
已经有11人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌中的质粒最大可以多少kb
已经有6人回复
- 请问大肠杆菌培养液里的乳白色沉淀是什么，4度能保存多长时间，质粒活性怎么样？
已经有4人回复
lihe131
至尊木虫 (文坛精英)
- 应助: 106 (高中生)
- 金币: 12400.9
- 散金: 3690
- 红花: 10
- 帖子: 14218
- 在线: 263.6小时
- 虫号: 504554
- 注册: 2008-02-16
- 性别: GG
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
2楼2014-04-15 15:02:54
Neo2000
木虫 (著名写手)
- 应助: 639 (博士)
- 金币: 8720.2
- 红花: 37
- 帖子: 1700
- 在线: 269.3小时
- 虫号: 322365
- 注册: 2007-03-11
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
3楼2014-04-15 17:23:43
4楼2014-04-15 18:42:47
5楼2014-04-16 09:40:42
6楼2014-04-16 09:47:54
mada1986
木虫 (小有名气)
- 应助: 41 (小学生)
- 金币: 3340.8
- 红花: 7
- 帖子: 127
- 在线: 57.6小时
- 虫号: 425672
- 注册: 2007-07-28
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
7楼2014-04-16 13:15:18
8楼2014-05-15 10:32:52
9楼2014-05-19 15:12:28
10楼2014-06-12 09:45:45
28