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大肠杆菌培养 质粒提取后困惑已有8人参与
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最近老师要求做 实时荧光定量PCR的细菌16S rRNA基因全长的标品。老师说，用质粒克隆的方法制备这样的标品。具体操作如下： 1.JM109 16s RNA基因全长的扩增（27f-1492r) 2.切胶纯化回收 3.目的基因与载体（PMD 19-T vector）的连接：10ul，4℃，过夜。 4.将连接有目的基因的载体转化至感受态细胞 DH5α：50ul感受态细胞与10ul以上溶液（第3步的）混合，冰上30min，42℃ 45s，冰上1min，加440ul SOC培养基37℃，180rpm，培养1h。 5.涂布：配制LB培养基，灭菌稍冷却后，添加1/1000的Amp，倒平板制成固体培养基。混合30ul x-gal、7ul IPTG和63ul ddH2O，加至固体平板上，涂布均匀。 取10u l第4步培养液，混合90ul灭菌dd H2O,相当于稀释10倍后，加至固体平板上，涂布均匀。 6.培养：倒置平板，待平板上的冷凝水晾干后，置于37℃，静置培养过夜。 7.蓝白斑筛选，培养：取出培养基，挑取白斑至3-4ml LB液体培养基（灭菌冷却后加1/1000Amp）中，37℃，180rpm，几个小时后，转移至100ml LB液体培养基中（灭菌冷却后加1/1000Amp）。37℃，180rpm，16h。 8.质粒提取：取第7步培养后的菌液5ml，离心，弃上清。步骤按照TIANGEN质粒提取试剂盒。 问题就卡在了质粒提取后，出现3个条带，如图跑得最快的两条最亮。问过同实验室的师兄师姐，他们说未遇到过这种情况，他们提出来的质粒都是两条，一条是不亮的基因组DNA，一条是亮的质粒。我不知道我的是怎么回事，质粒提取操作重复两次，仍是一样的结果。求解。  E.coli 质粒的提取.png |
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