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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 大肠杆菌培养 质粒提取后困惑
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nbzhenzhen

新虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌培养 质粒提取后困惑已有8人参与

最近老师要求做   实时荧光定量PCR的细菌16S rRNA基因全长的标品。老师说，用质粒克隆的方法制备这样的标品。具体操作如下：
1.JM109 16s RNA基因全长的扩增（27f-1492r)
2.切胶纯化回收
3.目的基因与载体（PMD 19-T vector）的连接：10ul，4℃，过夜。
4.将连接有目的基因的载体转化至感受态细胞 DH5α：50ul感受态细胞与10ul以上溶液（第3步的）混合，冰上30min，42℃ 45s，冰上1min，加440ul SOC培养基37℃，180rpm，培养1h。
5.涂布：配制LB培养基，灭菌稍冷却后，添加1/1000的Amp，倒平板制成固体培养基。混合30ul x-gal、7ul IPTG和63ul ddH2O，加至固体平板上，涂布均匀。
             取10u l第4步培养液，混合90ul灭菌dd H2O,相当于稀释10倍后，加至固体平板上，涂布均匀。
6.培养：倒置平板，待平板上的冷凝水晾干后，置于37℃，静置培养过夜。
7.蓝白斑筛选，培养：取出培养基，挑取白斑至3-4ml LB液体培养基（灭菌冷却后加1/1000Amp）中，37℃，180rpm，几个小时后，转移至100ml LB液体培养基中（灭菌冷却后加1/1000Amp）。37℃，180rpm，16h。
8.质粒提取：取第7步培养后的菌液5ml，离心，弃上清。步骤按照TIANGEN质粒提取试剂盒。
问题就卡在了质粒提取后，出现3个条带，如图跑得最快的两条最亮。问过同实验室的师兄师姐，他们说未遇到过这种情况，他们提出来的质粒都是两条，一条是不亮的基因组DNA，一条是亮的质粒。我不知道我的是怎么回事，质粒提取操作重复两次，仍是一样的结果。求解。

大肠杆菌培养  质粒提取后困惑
E.coli 质粒的提取.png
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1楼2014-04-14 21:43:14
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残剑流霜

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

挺漂亮的质粒提取啊……没问题的
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9楼2014-05-19 15:12:28
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-15 13:25:06
质粒分为超螺旋、缺刻和线性的，表观迁移率不同。你查查生化书吧，写得很清楚的。
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2楼2014-04-15 15:02:54
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很正常，没必要纠结

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-04-15 17:23:43
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
nbzhenzhen(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-16 19:25:04
这是正常现象，你确定你问的那些人说不知道？！据了解，其实远不止3条带，
但是，一般情况下，看到两条活着三个是没问题的。。。
如果感兴趣，你可以查一下关于质粒的具体介绍。。。
赞一下 回复此楼
4楼2014-04-15 18:42:47
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