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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 求助大肠杆菌发酵问题
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hanjun80

金虫 (正式写手)

[求助] 求助大肠杆菌发酵问题已有1人参与

我们在做大肠杆菌的工程菌株发酵。以下是基本信息：
菌株为B21(DE3)；
携带质粒为PTRC99Z质粒（有外源基因）；
发酵罐：5L
培养基：多种培养基都试过。包括无机盐、复合培养基（配方见《高细胞密度发酵技术》 李寅 等 著，化学工业出版社）。碳源用过葡萄糖以及甘油，现象相似。
发酵液pH:6.8，以氨水调控；
发酵罐温度：25~30都用过，用以调节发酵初期细菌比生长速率；
发酵罐罐压：0.06、0.04MPa以及0.02MPa都试过；
转速：从400~900rpm都试过；
通气量：200L/h到400L/h都试过；
通过补料速率，控制溶氧为30%；

用的有机氮源:
1.酵母抽提物
2.蛋白胨
3.蛋白胨+酵母抽提物;

无机氮源：
1、磷酸二氢铵；
2、硫酸铵。

至于碳源浓度,都是培养基的初始碳源消耗完以后才开始流加，甘油做碳源的时候我没有测过培养基的碳源浓度，但是葡萄糖做碳源时候，斐林试剂滴定法测碳源浓度发现葡萄糖浓度较低，我的溶氧是由碳源流加速度控制的，溶氧浓度在30~60％。

乙酸的确抑制大肠杆菌生长，但是乙酸合成原因是什么?我一直怀疑是种子或溶氧的问题，造成乙酸的合成，进而抑制大肠杆菌生长，因为1）我们的甘油种子是保存在-20℃;2）很多文献包括论坛上都说要通入高浓度氧，而我从来没有用过。  

现象：
不管培养基、发酵工艺是什么样，每次菌长到0D600=30，就开始增长速度极慢（期间没有加任何诱导剂哦）；尽管发酵液离心后沉淀量一直增加，但是OD600的吸光值变化不大，甚至有所降低；
发酵液粘度增加，泡沫较大；
碳源一直在消耗，但是生物量不增加，产酸量大（因为消耗氨水量大）；
离心后，菌泥呈两种颜色，下层为乳白色（颜色稍稍淡黄，健康大肠杆菌颜色），上层颜色较深。

遂请问各位达人，上述现象原因为何？如何解决这些问题？不通入高浓度氧时候，OD最高能到多少（请生产PHB和PHA的朋友忽略这个问题）？

[ Last edited by hanjun80 on 2012-12-10 at 05:43 ]
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1楼2012-12-10 05:35:06
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-12-10 08:29:11
hanjun80: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢，同是大肠杆菌BL21(DE3)菌株，有些就木有这个现象 2012-12-10 12:01:53
楼主也做过PHA吧。粘度增加有可能是胞外多糖的积累，也可能是菌体自溶；我也在做有机酸，觉得过量积累会抑制菌体生长，正准备做敲除，但是不是大肠。另一个抑制产酸的方法是降低并严格控制碳源的浓度。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2012-12-10 08:07:31
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m_rna

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hanjun80: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-12-10 13:15:03
哥们，建议你测下发酵后期氨基氮含量，个人认为是你后期有机氮源不足，留加氨水可以使铵根离子含量提高很多，可能是你铵根离子含量过高，而氨基氮含量较低引起菌体量和外援蛋白产量偏低的原因。个人意见，仅供参考。
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小强
3楼2012-12-10 09:58:27
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hanjun80

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-10 08:07:31
楼主也做过PHA吧。粘度增加有可能是胞外多糖的积累，也可能是菌体自溶；我也在做有机酸，觉得过量积累会抑制菌体生长，正准备做敲除，但是不是大肠。另一个抑制产酸的方法是降低并严格控制碳源的浓度。
...

我不是做PHA的。
之所以提到PHA，因为大肠杆菌产PHA做出来的OD虚高，不能作为参考。
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4楼2012-12-10 12:01:11
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ck9879

银虫 (初入文坛)
后期，DO可以试着控制在20-30%，可能减少乙酸的生成
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5楼2012-12-10 13:00:50
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hanjun80

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ck9879 at 2012-12-10 13:00:50
后期，DO可以试着控制在20-30%，可能减少乙酸的生成

嗯，多谢，偶的DO控制在30~60%。
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6楼2012-12-10 13:16:35
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小花木兰

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hanjun80 at 2012-12-10 13:16:35
嗯，多谢，偶的DO控制在30~60%。...

你补料吗，提出培养基中有机氮，可以提高OD，如果补料，则中后期OD较高
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7楼2012-12-10 20:01:31
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zcqh27

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
按照你流加葡萄糖的方法，应该不会积累乙酸，可能是代谢途径的问题吧。而且流加葡萄糖以控溶氧，那么应该检测不到葡萄糖的。如果能检测到葡萄糖，说明葡萄糖就不是限制菌体生长的原因，那么乙酸较多，只能是你的溶氧太低了。
OD到30就不长了？用氨水调节pH不存在氮源不足的问题，可以试着，把你培养基中的微量元素增加一倍。
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8楼2012-12-12 10:03:57
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

乙酸的产生是你的菌生长太快导致的，一般生长速率超过0.17就会产生乙酸，还有你的甘油菌保存在-20是不行的保存时间太短，应该放在-80.
粘度增加，重你的描述来看应该是自溶了，上层为褐色菌体，应该是碳氮比后期不适当。
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9楼2013-05-24 11:13:42
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luly紫琳

新虫 (小有名气)
想请问下你的问题的解决了吗，我的大肠杆菌发酵也是如此，糖浓都在0.1g/L以下了，菌浓还是只能长到OD600左右。
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1%的运气需要99%的努力付出
10楼2014-04-07 21:26:23
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