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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌ET12567
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芥末蚕豆

铜虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌ET12567

我将构建好的一个质粒转化大肠杆菌ET12567,用的是CaCl2法制备ET12567感受态，菌液PCR验证、提取质粒酶切验证均正确，将验证正确的菌用20％甘油保存在－20度；
      此时问题出现了：将甘油保藏管菌液重新接LB小试管（含抗性），提质粒，但是此时却见不到质粒的条带了，Why？（ps:提质粒用的试剂是别人刚刚提过质粒的，应该没问题；LB小试管菌长得很好很正常）。我也试过将甘油保藏管菌液先在LB（含同样抗生素）平板活化，然后再接小试管提质粒，结果电泳也没见到我所要的质粒条带（PS：电泳和别人一起跑的，别人的有条带，电泳应该是没问题的）
有没有高手比较连接这个菌种！非常感谢！
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开心就好！
1楼 2011-09-20 00:14:57
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-20 08:02:16
是不是保存的时候出问题了，比如保存前的菌培养没加抗生素，质粒丢失了或染菌了。。。。。。
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2楼2011-09-20 07:26:31
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芥末蚕豆

铜虫 (初入文坛)
应该不是保存的问题，之后我重新保存过好几次，抗生素应该也是没错的，大家都没有问题！染菌也不像！
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开心就好！
3楼2011-09-20 08:52:05
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): good 2011-09-20 18:06:28
那你质粒有么有保存？重新导入回去也是可以的。
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4楼2011-09-20 14:29:14
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friya0910

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 我们用的很高，-20度用50%的甘油…… 2011-09-20 18:07:05
引用回帖:
1楼: Originally posted by 芥末蚕豆 at 2011-09-20 00:14:57:
我将构建好的一个质粒转化大肠杆菌ET12567,用的是CaCl2法制备ET12567感受态，菌液PCR验证、提取质粒酶切验证均正确，将验证正确的菌用20％甘油保存在－20度；
      此时问题出现了：将甘油保藏管菌液重新接LB小 ...

好像有说甘油浓度太高会导致质粒不稳定的，我一般都用8%的甘油浓度保菌的！会不会是你的甘油浓度太大了。
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5楼2011-09-20 14:40:18
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芥末蚕豆

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by friya0910 at 2011-09-20 14:40:18:
好像有说甘油浓度太高会导致质粒不稳定的，我一般都用8%的甘油浓度保菌的！会不会是你的甘油浓度太大了。

是吗？还有这样的说法啊？我试试看！也有说是安普霉素浓度有点低，我也在增加！都试试看吧！非常感谢大家都我的帮助！
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6楼2011-09-20 18:26:07
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清风寨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-21 07:53:37
那就不要保存 菌液了 保存质粒啊  质粒好保存 用的时候重新转化不就ok
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冷风过心变热
7楼2011-09-20 21:49:50
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张玉杰

铜虫 (初入文坛)
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2012-02-22 18:36:30
引用回帖:
1楼: Originally posted by 芥末蚕豆 at 2011-09-20 00:14:57:
我将构建好的一个质粒转化大肠杆菌ET12567,用的是CaCl2法制备ET12567感受态，菌液PCR验证、提取质粒酶切验证均正确，将验证正确的菌用20％甘油保存在－20度；
      此时问题出现了：将甘油保藏管菌液重新接LB小 ...

ET12567中含有核酸酶，很容易讲解质粒DNA。你的重组质粒可能就是被降解了，我也出现过跟你一样的情况。后来我又重做的连接、转化。
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8楼2012-02-22 17:00:17
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仇峰12306

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 芥末蚕豆 at 2011-09-20 18:26:07
是吗？还有这样的说法啊？我试试看！也有说是安普霉素浓度有点低，我也在增加！都试试看吧！非常感谢大家都我的帮助！...

能问个问题吗？我现在用安普质粒导到DH5a里不长，这个质粒是之前老师给的，想问你安普导入的大肠是什么菌啊？
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9楼2016-03-17 08:52:54
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