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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 反向表达载体构建
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] 反向表达载体构建 已有1人参与

大家好，我现在初学载体构建方面知识。有2个问题查了很多资料都弄不明白。
1 PUCM-T载体插入PCR产物，由于PCR产物3‘端加A，PUCM-T载体是3’端加T，那岂不是只有正向基因的A才能和载体的T配对，反向的插入是连接不上的？
2 构建好的PBI121表达载体进行酶切鉴定时，是直接将质粒酶切就跑电泳鉴定呢？还是酶切后PCR再电泳？一个模板上2个上游引物为什么PCR没产物呢？
不好意思，感觉很低级的问题。。。
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1楼 2014-05-23 15:19:32
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DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+2 2014-05-23 16:39:33
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-23 17:10:55
1 PUCM-T载体插入PCR产物，由于PCR产物3‘端加A，PUCM-T载体是3’端加T，那岂不是只有正向基因的A才能和载体的T配对，反向的插入是连接不上的？
是的，反向连不上。不过你要注意一般只有TAQ酶才会在产物上带a。一般的高保真酶的产物是不带a的，你需要自己加a。如果你想克隆反向产物，你就得找其他酶切位点，或者重写找个载体平端克隆。
2 构建好的PBI121表达载体进行酶切鉴定时，是直接将质粒酶切就跑电泳鉴定呢？还是酶切后PCR再电泳？一个模板上2个上游引物为什么PCR没产物呢？
你得先提取质粒，然后酶切直接电泳。你也可以先pcr鉴定是否有片段插入，然后再提质粒酶切电泳。
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2楼2014-05-23 16:08:16
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DAX1

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-23 16:08:16
1 PUCM-T载体插入PCR产物，由于PCR产物3‘端加A，PUCM-T载体是3’端加T，那岂不是只有正向基因的A才能和载体的T配对，反向的插入是连接不上的？
是的，反向连不上。不过你要注意一般只有TAQ酶才会在产物上带a。一般 ...

忘了回复你的另一个问题，两个上游引物他怎么可能有产物呢，楼主你需要看看pcr的基本原理什么。
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3楼2014-05-23 16:10:37
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-23 16:10:37
忘了回复你的另一个问题，两个上游引物他怎么可能有产物呢，楼主你需要看看pcr的基本原理什么。...

嘿嘿，一直以解链的下游单链为模板P啊？是量不够？
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4楼2014-05-23 16:38:06
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2014-05-23 16:08:16
1 PUCM-T载体插入PCR产物，由于PCR产物3‘端加A，PUCM-T载体是3’端加T，那岂不是只有正向基因的A才能和载体的T配对，反向的插入是连接不上的？
是的，反向连不上。不过你要注意一般只有TAQ酶才会在产物上带a。一般 ...

谢谢你！那一般反义载体构建是怎么做呢？我看好几个硕士论文都是用PUCM-T载体呢，就是过程不详细，我想不通
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5楼2014-05-23 16:39:26
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DAX1

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shiliyusly at 2014-05-23 16:38:06
嘿嘿，一直以解链的下游单链为模板P啊？是量不够？...

如果引物都在上游的话，那理论上你的引物都是从左向右扩增啊，那怎么可以得到你想要的产物呢，你得有个引物从右往左扩增啊，这样你才能得到你想要得片段
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6楼2014-05-23 16:51:10
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DAX1

新虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-23 17:11:05
引用回帖:
5楼: Originally posted by shiliyusly at 2014-05-23 16:39:26
谢谢你！那一般反义载体构建是怎么做呢？我看好几个硕士论文都是用PUCM-T载体呢，就是过程不详细，我想不通...

1，你可以在引物两边设计两个不同粘端酶切位点（针对你得载体得），位置和你载体得刚好相反，比如你得a位点在上游引物，然后a位点在你得载体得右边。我想你得载体应该有很多多克隆位点吧。
2，就是看看你的载体是否有平端位点，找个高保真酶pcr，产物就不会带a，这样理论上你插入得片段一半机会会是反向得
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7楼2014-05-23 16:56:06
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