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shiliyusly新虫 (小有名气)
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[求助]
反向表达载体构建 已有1人参与
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大家好，我现在初学载体构建方面知识。有2个问题查了很多资料都弄不明白。 1 PUCM-T载体插入PCR产物，由于PCR产物3‘端加A，PUCM-T载体是3’端加T，那岂不是只有正向基因的A才能和载体的T配对，反向的插入是连接不上的？ 2 构建好的PBI121表达载体进行酶切鉴定时，是直接将质粒酶切就跑电泳鉴定呢？还是酶切后PCR再电泳？一个模板上2个上游引物为什么PCR没产物呢？ 不好意思，感觉很低级的问题。。。 |
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6楼2014-05-23 16:51:10
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+2 2014-05-23 16:39:33
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-23 17:10:55
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1 PUCM-T载体插入PCR产物，由于PCR产物3‘端加A，PUCM-T载体是3’端加T，那岂不是只有正向基因的A才能和载体的T配对，反向的插入是连接不上的？ 是的，反向连不上。不过你要注意一般只有TAQ酶才会在产物上带a。一般的高保真酶的产物是不带a的，你需要自己加a。如果你想克隆反向产物，你就得找其他酶切位点，或者重写找个载体平端克隆。 2 构建好的PBI121表达载体进行酶切鉴定时，是直接将质粒酶切就跑电泳鉴定呢？还是酶切后PCR再电泳？一个模板上2个上游引物为什么PCR没产物呢？ 你得先提取质粒，然后酶切直接电泳。你也可以先pcr鉴定是否有片段插入，然后再提质粒酶切电泳。 |
2楼2014-05-23 16:08:16
3楼2014-05-23 16:10:37
shiliyusly
新虫 (小有名气)
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4楼2014-05-23 16:38:06
200