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love犬夜叉木虫 (小有名气)
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测序结果引物部分跟原本应该的序列相比少个碱基，是引物的问题还是连接过程中丢失？ 已有1人参与
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| 我一段基因序列在一头一尾各加上一个酶切位点，然后设计的引物做PCR，然后连接到19T载体后测序，两次测序结果都显示在尾部的酶切识别位点少一个T碱基，请问下这是因为引物在合成时就少了一个T，还是在PCR过程中丢失了一个T？我还要继续做下去么？（酶切下来练到表达载体上？）还是重新做一次PCR，再连接测序？ |
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4楼2014-05-24 19:01:12
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
love犬夜叉(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-05-24 22:52:51
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love犬夜叉(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-05-24 22:52:51
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酶切，能切下来就是正确的。测序数据前面20个左右的碱基和800以后的碱基可信度不是太高，如果出错在这些区域重新选择测序引物。 PS： Sanger法测序，在测序反应结束后，需要进行乙醇纯化的步骤，一般30bp以内的小片段会丢失，所以所得测序数据的起始碱基是测序引物后30bp以外的序列。当用PCR引物作为测序引物时，测序结果中是不包含引物序列的。若希望得到引物序列，可通过以下两种方法：① 对于长度<800bp的PCR产物，可用另一端的引物进行测序，所得序列的末端就包含引物的反向互补序列。② 对于较长的序列，一个测序反应无法测通，可通过将PCR产物片段克隆到适当的载体，用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与插入序列之间还有一段距离，因此可以获得完整的PCR引物序列。另外，测序起始端的碱基容易发生误读，若您希望获得PCR产物的完整序列，建议克隆后再测序。 |
2楼2014-05-23 08:39:07
love犬夜叉
木虫 (小有名气)
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3楼2014-05-24 16:23:41
