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shuiniu87987银虫 (小有名气)
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Takara的BamHI和XhoI双酶切求助 已有2人参与
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| 最近酶切连接转化后一直没菌落，请大家看看问题出在哪？ 50微升双酶切体系：通用buffer 是10乘K buffer 5微升，BamHI和XhoI各加2.5微升，质粒2微克，加水至50微升。然后37度2小时，30度两小时，结束。请问大家Buffer是不是加少了，还是Takara的酶效率不高，需要延长酶切时间？酶切跑电泳条带后的质粒和目的片段条带均清晰。连接用的Takara的T4连接酶，16度连接10h，25微升体系，摩尔比是1:6，说明书要求分别是0.3pmol和0.03pmol，转化为质量大概是200ng（目的片段）和100ng（质粒），我只加了80ng（目的片段）和50ng（质粒），请问这会影响吗？培养基和感受态均做过对照，没问题。谢谢回答。 |
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2楼2014-05-08 22:52:56
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连接用的Takara的T4连接酶，16度连接10h，25微升体系，摩尔比是1:6，说明书要求分别是0.3pmol和0.03pmol，转化为质量大概是200ng（目的片段）和100ng（质粒），我只加了80ng（目的片段）和50ng（质粒），请问这会影响吗？ 为什么不用Takara出的连接试剂盒呢，就比单买连接酶贵50块吧，但效果是完全不一样的。 |
3楼2014-05-08 23:20:26
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