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summermio

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[求助] 同源重组阳性单菌落问题已有2人参与

最近在做同源重组，想把一个荧光蛋白的基因整合到大肠杆菌基因组的某个地方里，用的是 red recombinase. 好不容易筛选到几个阳性菌落后做菌落PCR，引物选用construct上下游的各一段基因，可是每个单菌落pcr出来都有两条带，一条大小2kb，恰好是整合进去的结果，一条是300bp（类似WT的结果），是没整合进去的意思。我以为是单菌落不纯，于是用验证过的阳性单菌落再涂reduction plate，再挑单菌落pcr得出来的结果还是混合2kb条带和300bp条带的结果，为啥一个单菌落里会有两种基因型呢？？？？各位大侠有什么解释和办法么，，，好不容易有一个结果~~~(>_<

~~~

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1楼 2014-04-30 02:11:41

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meng_xu

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-04-30 10:41:25

嗯，是不是基因组里其他地方有类似的序列呢？染色体重组做的少，不过有篇不错的文章，不知道你看了没有
One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products
Kirill A. Datsenko and Barry L. Wanner 2000 PNAS vol 97 6640–6645

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2楼2014-04-30 05:32:16

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summermio

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引用回帖:

2楼: Originally posted by meng_xu at 2014-04-30 05:32:16
嗯，是不是基因组里其他地方有类似的序列呢？染色体重组做的少，不过有篇不错的文章，不知道你看了没有
One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products
Kirill A. Dat ...