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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 同源重组阳性单菌落问题
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summermio

新虫 (初入文坛)

[求助] 同源重组阳性单菌落问题 已有2人参与

最近在做同源重组， 想把一个荧光蛋白的基因整合到大肠杆菌基因组的某个地方里， 用的是 red recombinase. 好不容易筛选到几个阳性菌落后做菌落PCR， 引物选用construct上下游的各一段基因，可是每个单菌落pcr出来都有两条带， 一条大小2kb，恰好是整合进去的结果，一条是300bp（类似WT的结果）， 是没整合进去的意思。 我以为是单菌落不纯， 于是用验证过的阳性单菌落再涂reduction plate， 再挑单菌落pcr得出来的结果还是混合2kb条带和300bp条带的结果，为啥一个单菌落里会有两种基因型呢？？？？各位大侠有什么解释和办法么，，，好不容易有一个结果~~~(>_<~~~
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1楼 2014-04-30 02:11:41
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-04-30 10:41:25
嗯，是不是基因组里其他地方有类似的序列呢？染色体重组做的少，不过有篇不错的文章，不知道你看了没有
One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products
Kirill A. Datsenko and Barry L. Wanner 2000 PNAS vol 97 6640–6645
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2楼2014-04-30 05:32:16
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summermio

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by meng_xu at 2014-04-30 05:32:16
嗯，是不是基因组里其他地方有类似的序列呢？染色体重组做的少，不过有篇不错的文章，不知道你看了没有
One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products
Kirill A. Dat ...

必须看了呀。基本就是按着这个做的。
我觉得可能性比较小， 不太可能基因组其他位置的序列pcr扩出来的片段连大小（300bp）也和正确位置的一样吧。。
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3楼2014-04-30 18:52:59
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
不知道你转化的DNA是线型还是环形？筛选压力是什么？同源片段如何设计的？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-04-30 21:03:37
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summermio

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-04-30 21:03:37
不知道你转化的DNA是线型还是环形？筛选压力是什么？同源片段如何设计的？

线型 大概是这样   5‘--同源区----要加进去的基因--FRT---Kanamycin---FRT---同源区3’    大约共2kb 把这个construct接到一个基因组中一个基因的5’端
筛选压力 Kanamycin 40ug/ml
同源区 前后各45bp
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5楼2014-04-30 21:36:32
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
线型片段是PCR构建的还是从质粒上酶切下来的？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2014-05-01 01:46:14
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meng_xu

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by summermio at 2014-04-30 18:52:59
必须看了呀。基本就是按着这个做的。
我觉得可能性比较小， 不太可能基因组其他位置的序列pcr扩出来的片段连大小（300bp）也和正确位置的一样吧。。...

这个不知道，coli 里面的冗余也有，你可以blast一下，在酵母里，同样引物，可以P出来一样大小的带子，在不同的染色体上，因为有大片段的重复序列，我就遇到过。
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7楼2014-05-02 06:59:52
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summermio

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-05-01 01:46:14
线型片段是PCR构建的还是从质粒上酶切下来的？

PCR construct
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8楼2014-05-09 19:18:31
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

其实，你完全可以把你那两个片段回收之后，测序看看啊。小片段的序列结果和E.coli的基因组进行Blast就知道问题出在哪里了啊
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9楼2015-12-10 15:36:04
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