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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 姜的总RNA提取，电泳只有一条带
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夏菡小屋

金虫 (正式写手)

[求助] 姜的总RNA提取，电泳只有一条带已有5人参与

见图，这是我今天提取姜的总RNA结果图，旁边是TAKARA的DL5000 marker，用的是1.2%的普通琼脂糖凝胶电泳，总共提取了7管，用了三个不同的方法，其中一个方法（Lane 3）未见条带，其余均有明显条带，感觉有降解，但只有一个明显的条带，这是28s RNA吗？姜的28s 和18s，5s RNA到底是多大啊，求指导！！这种图显示，应该问题出在什么地方？

姜的总RNA提取，电泳只有一条带
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1楼2014-04-19 13:39:04
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夏菡小屋

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2014-04-19 17:27:13
你提取的这是DNA，RNA你根本没有提取出来

抽提缓冲液：0.25M NaCl，0.05M Tris-HCl（pH7.5），20mM EDTA，1%（w/v）SDS，4%(w/v) PVP(M.W.360,000)
提取步骤：
1.1.5ml离心管中加入0.5ml抽提缓冲液和0.5ml 苯酚氯仿异戊醇（25:24:1）；
2.0.5g冰冻样品至研钵中，在液氮存在下研磨成粉末；
3.转移1g样品至离心管中（步骤1），涡旋剧烈震荡混匀；
4.4℃离心12000rpm*10min；
5.转移上清至另一离心管中，加入等体积的 苯酚氯仿异戊醇（25:24:1），4℃离心12000rpm*3min，重复此步骤直到能看到一个清晰的界面；
6.转移上清至新的离心管中，加入十分之一体积3M醋酸钠(pH5.2)以及2.5倍体积冷无水乙醇，混匀后，4℃孵育30min；
7.再次4℃离心12000rpm*20min；
8.冷的70%乙醇洗涤后干燥，加入200μL DEPC处理水溶解沉淀；
9.转移上清至新的离心管中加入4M LiCl至终浓度为2M，冰上放置1h，4℃离心12000rpm*20min；
10. 冷的70%乙醇洗涤后干燥，加入50μL DEPC处理水溶解沉淀；

请问我的步骤有问题吗?
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4楼2014-04-19 17:48:16
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iamcsy

铜虫 (初入文坛)
就图片来看，太难看了！28s和18s都烂成这样，还想看5s呢！还有，DNA都没除尽。

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-04-19 15:55:56
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★
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夏菡小屋(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-30 21:06:49
你提取的这是DNA，RNA你根本没有提取出来
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2014-04-19 17:27:13
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夏菡小屋

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2014-04-19 17:27:13
你提取的这是DNA，RNA你根本没有提取出来

1. 1.5ml离心管中加入0.5ml抽提缓冲液和0.5ml苯酚氯仿异戊醇（PCI, 25：24：1）；
2.0.5g冰冻样品至研钵中，在液氮存在下研磨成粉末；
3.转移样品至离心管中（步骤1），涡旋剧烈震荡混匀；
4.室温离心12,857g*2min；
5.转移上清至另一离心管中，加入等体积的PCI，4℃离心12000*3min，重复此步骤直到能看到一个清晰的界面；
6.转移上清至新的离心管中，加入十分之一体积3M醋酸钠(pH5.2)以及2.5倍体积冷无水乙醇，混匀后，4℃孵育30min；
7.再次4℃离心12000**20min；
8.冷的70%乙醇洗涤后干燥，加入200μL DEPC处理水溶解沉淀；
9.转移上清至新的离心管中加入4M LiCl至终浓度为2M，冰上放置1h，4℃离心12000**20min；
10. 冷的70%乙醇洗涤后干燥，加入50μL DEPC处理水溶解沉淀.
11.普通琼脂糖凝胶电泳检测，1.2%胶。电泳至前沿。

请问我的步骤有问题吗？
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5楼2014-04-19 17:53:04
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