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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 利用DpnI酶切法构建缺失突变质粒
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wangtao89hf

新虫 (初入文坛)

[求助] 利用DpnI酶切法构建缺失突变质粒已有2人参与

我对一个操纵子的一段序列的十个部分要分别缺失突变，利用DpnI酶切反向PCR产物进行缺失，然后转化测序。目前已经成功了三个但是有7个多次重复都没成功。原因从购买新酶，酶切时间，DH5@以及TOP10感受态细胞都找了，连PCR循环的次数也验证了，而且阴性平板不长，挑单菌落测序又发现没有缺失，求高手指导给原因。
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@biostar2009

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1楼2014-04-11 14:19:03
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

我以前做过定点突变，应该做过20+吧，如果说有心得，那就是是模板质粒最好是每次都是立即提取，立即使用（不用冻存的），而且提取质粒过程中，操作要gentle, 一定要gentle。
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行至水穷处，坐看云起时
3楼2014-04-30 20:23:22
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

不好意思，你这个我不是很明白，我也没做过这个，不然你先讲清楚你怎么做的，我再帮你分析一下。
缺失突变，没问题
限制性内切酶切，环化连接，反向PCR没问题
这两个合一起什么意思？
你工作起始的模板是什么？
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2楼2014-04-30 14:45:27
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