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wangtao89hf

新虫 (初入文坛)

[求助] 利用DpnI酶切法构建缺失突变质粒 已有2人参与

我对一个操纵子的一段序列的十个部分要分别缺失突变,利用DpnI酶切反向PCR产物进行缺失,然后转化测序。目前已经成功了三个但是有7个多次重复都没成功。原因从购买新酶,酶切时间,DH5@以及TOP10感受态细胞都找了,连PCR循环的次数也验证了,而且阴性平板不长,挑单菌落测序又发现没有缺失,求高手指导给原因。
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

不好意思,你这个我不是很明白,我也没做过这个,不然你先讲清楚你怎么做的,我再帮你分析一下。
缺失突变,没问题
限制性内切酶切,环化连接,反向PCR没问题
这两个合一起什么意思?
你工作起始的模板是什么?
2楼2014-04-30 14:45:27
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

我以前做过定点突变,应该做过20+吧,如果说有心得,那就是是模板质粒最好是每次都是立即提取,立即使用(不用冻存的),而且提取质粒过程中,操作要gentle, 一定要gentle。
行至水穷处,坐看云起时
3楼2014-04-30 20:23:22
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凌儿凌夷

铜虫 (小有名气)

4楼2019-04-08 14:17:00
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