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zcf1990

银虫 (初入文坛)

[求助] PCR定点突变遇到问题 已有3人参与

亲们,我在做定点突变,但是碰到了以下问题;看哪位高手有没有碰到我这种情况:
我的PCR整个过程没有问题,克隆也能顺利长出;测序后与正向引物比对发现以下问题,就是引物比对是对的,引物之前的碱基也是对的,该突变的位点也是对的;但是在引物最后的碱基又接了一段一模一样的引物片段等于重复了一模一样的引物长度;在重复的引物片段又能接上模板之后的序列;该种情况不止出现一次;求解~~~
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

扩增完了你切胶回收的吗?会不会是连接进去的?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2013-06-14 08:16:53
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zcf1990

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2013-06-14 08:16:53
扩增完了你切胶回收的吗?会不会是连接进去的?

我单纯的做定点突变,不需要胶回收;扩增完了,直接用DPnI去甲基化后转化~~
3楼2013-06-14 08:23:02
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水花微谢

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
减少引物浓度试试
4楼2013-06-14 12:31:32
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zcf1990

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 水花微谢 at 2013-06-14 12:31:32
减少引物浓度试试

请问你有碰到过这种情况吗?我分析不出到底是PCR中哪里出了问题~~
5楼2013-06-14 12:40:29
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A_there

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2013-06-14 08:16:53
扩增完了你切胶回收的吗?会不会是连接进去的?

我切胶回收后也出现楼主的情况了 请问你知道为什么会连进去吗?
谢谢~
6楼2013-10-25 08:50:01
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junefan7896

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也出现了这样的情况,可能的原因有两个,引物的质量不行,用HPSF的活HPLC纯化的引物试试,另外我剪短了退火时间,就只有一个repeat了
7楼2014-11-20 22:52:02
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花散夕阳

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

再挑一个试试,不行就重p,我今天遇到了一样的问题,6个点突变,其中竟然就有两个是这样的问题
8楼2015-12-10 19:24:00
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zl2670053160

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 花散夕阳 at 2015-12-10 19:24:00
再挑一个试试,不行就重p,我今天遇到了一样的问题,6个点突变,其中竟然就有两个是这样的问题

最近我也在做这部分工作,遇到了点麻烦,想要和前辈们问问。望不吝赐教。
9楼2016-07-11 11:44:07
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zl2670053160

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

最近做这方面的内容,点突变遇到了点问题,望请教
10楼2016-07-11 11:46:24
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