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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 亲们，你们做定点突变么？
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

[求助] 亲们，你们做定点突变么？

最近在做定点突变，用的trans的定点突变的试剂盒，但是就是没有条带，我是希望在病毒基因组全场位置上突变两个碱基，有做过的人，能稍微知道下么，病毒基因组加上质粒载体一共12k,trans公司的人说可能是由于模板比较大的原因，你们做定点突变都是怎么做的，有什么经验能分享么，每次PCR都是P不出来，快郁闷死了。。。
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1楼 2012-11-10 17:45:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhoumin1108

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

做点突变根本不需要kit,也不需要PCR全长质粒,用overlapPCR直接PCR突变基因就可以了,还不需要dpnI酶切.
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15楼2012-11-14 13:53:46
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liuan6126

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议在T载体上突变好了再连目标载体，载体太大了，PCR不大容易
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2楼2012-11-11 11:14:58
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polepolar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 编辑内容 2013-05-29 19:30
确实是因为模板太大的原因,现有的聚合酶扩增不了这么大的片段,建议交给公司做吧

[ Last edited by gyesang on 2013-5-29 at 19:30 ]
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北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
3楼2012-11-12 14:29:44
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-11 11:14:58
建议在T载体上突变好了再连目标载体，载体太大了，PCR不大容易

在T载体上做好突变？这样子是不是比较容易？你之前有做过么，有成功的例子没？
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4楼2012-11-12 15:54:32
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by polepolar at 2012-11-12 14:29:44
确实是因为模板太大的原因,现有的聚合酶扩增不了这么大的片段,建议交给公司做吧,可以关注一下北京普尔普乐生物技术有限公司.

额。。。。那你们公司用怎样的聚合酶，为什么能够进行如此之大的扩增变异呢？
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5楼2012-11-12 15:55:12
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polepolar

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-12 15:55:12
额。。。。那你们公司用怎样的聚合酶，为什么能够进行如此之大的扩增变异呢？...

我们的做法与点突变试剂盒的做法不一样,是采用其它的策略,所以对于很长的序列我们也可以进行定点突变.
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北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
6楼2012-11-12 17:37:13
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timmychina

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-14 16:37:11
我最近正在做全质粒定点突变，我的重组质粒是7kb,还是比较容易得到产物。
如果确定你是质粒太大的原因而不是PCR各种条件的因素，那么就换一种方法吧。貌似有种试剂盒是进行突变点区域小片段的置换进行突变的，可以搜搜。
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彩云之南的愿望还能实现吗
7楼2012-11-12 19:48:15
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wangtaodluf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
片段太长的话一是不好P出来，二是保真上也不好说。可以尝试用OVERLAP PCR来做定点突变。
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8楼2012-11-13 08:43:36
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liuan6126

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-12 15:54:32
在T载体上做好突变？这样子是不是比较容易？你之前有做过么，有成功的例子没？...

一般都在T载体上做好了，测序正确了再导入目的载体，你直接在目的载体上做，12 K是蛮大的，延伸时间12 min，是很难PCR出来的。希望对您有用。
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9楼2012-11-13 13:50:52
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-13 13:50:52
一般都在T载体上做好了，测序正确了再导入目的载体，你直接在目的载体上做，12 K是蛮大的，延伸时间12 min，是很难PCR出来的。希望对您有用。...

谢谢啦，准备中，打算把需要突变的部分连上19T ，然后在酶切连到我的目的载体上，尝试下吧，看看能不能成功。另外你之前做过没，T载体的选择，我们实验室有19T还厚promega的PGEM-TEasy,哪个载体比较好做呢？
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10楼2012-11-13 16:46:26
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