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sarah-miao

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8楼: Originally posted by wangtaodluf at 2012-11-13 08:43:36
片段太长的话一是不好P出来，二是保真上也不好说。可以尝试用OVERLAP PCR来做定点突变。

可以具体介绍下怎么做的么？不是很理解

11楼2012-11-13 16:47:02

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sarah-miao

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7楼: Originally posted by timmychina at 2012-11-12 19:48:15
我最近正在做全质粒定点突变，我的重组质粒是7kb,还是比较容易得到产物。
如果确定你是质粒太大的原因而不是PCR各种条件的因素，那么就换一种方法吧。貌似有种试剂盒是进行突变点区域小片段的置换进行突变的，可以 ...

哦哦，这样啊，我参考一楼的建议，准备现在T载体上做个突变，然后连接到目的载体上去呢，你用的哪家的定点突变的试剂盒啊？

12楼2012-11-13 16:48:08

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sarah-miao

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6楼: Originally posted by polepolar at 2012-11-12 17:37:13
我们的做法与点突变试剂盒的做法不一样,是采用其它的策略,所以对于很长的序列我们也可以进行定点突变....

是连到T载体上，突变完成后再连接到目的载体上么？

13楼2012-11-13 16:49:08

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timmychina

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12楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-13 16:48:08
哦哦，这样啊，我参考一楼的建议，准备现在T载体上做个突变，然后连接到目的载体上去呢，你用的哪家的定点突变的试剂盒啊？...

也是全式金的 FM111

彩云之南的愿望还能实现吗

14楼2012-11-14 12:08:47

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zhoumin1108

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【答案】应助回帖

做点突变根本不需要kit,也不需要PCR全长质粒,用overlapPCR直接PCR突变基因就可以了,还不需要dpnI酶切.

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15楼2012-11-14 13:53:46

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13楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-13 16:49:08
是连到T载体上，突变完成后再连接到目的载体上么？...

采用重叠PCR的方法,在要突变的位置附近找到最近的两个酶切位点切开,设计引物将切去的片断做突变,再连回打开的载体.如果不明白的话,可以QQ:1602396197,我给你设计引物和方案.

北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)

16楼2012-11-14 19:59:52

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【答案】应助回帖

直接扩也是可行的，不过需要使用强悍一点的聚合酶，PCR然后DpnI，再然后转化就可以了。聚合酶用过一款叫Phusion的不错。
overlap也是可行的，
T载体也不赖，就是还都要酶切连接，比较麻烦。

小兵一个

17楼2012-11-16 15:59:37

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sarah-miao

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6楼: Originally posted by polepolar at 2012-11-12 17:37:13
我们的做法与点突变试剂盒的做法不一样,是采用其它的策略,所以对于很长的序列我们也可以进行定点突变....

是连到T载体上再突变，然后再连回目的载体么？

18楼2012-11-21 10:41:09

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sarah-miao

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7楼: Originally posted by timmychina at 2012-11-12 19:48:15
我最近正在做全质粒定点突变，我的重组质粒是7kb,还是比较容易得到产物。
如果确定你是质粒太大的原因而不是PCR各种条件的因素，那么就换一种方法吧。貌似有种试剂盒是进行突变点区域小片段的置换进行突变的，可以 ...

你用的是哪一家的定点突变的试剂盒啊？我给突变位置连接到19T上准备用全式金的试剂盒，但是还是不是很顺利，你用的哪家，可以推荐下啊？

19楼2012-11-21 10:42:27

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sarah-miao

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8楼: Originally posted by wangtaodluf at 2012-11-13 08:43:36
片段太长的话一是不好P出来，二是保真上也不好说。可以尝试用OVERLAP PCR来做定点突变。

用OVERLAP是怎样的原理啊？

20楼2012-11-21 10:42:53

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