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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 亲们，你们做定点突变么？
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-13 13:50:52
一般都在T载体上做好了，测序正确了再导入目的载体，你直接在目的载体上做，12 K是蛮大的，延伸时间12 min，是很难PCR出来的。希望对您有用。...

嗯嗯，听了您的建议给连到19T上去了，现在准备在19T上做突变，突变成功测序后在连回到目的载体上，万分感谢哈，不过我想问问一般做定点突变用哪家的试剂盒比较好啊？再次感谢啦
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21楼2012-11-21 10:44:47
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
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14楼: Originally posted by timmychina at 2012-11-14 12:08:47
也是全式金的  FM111...

哦哦，我看看哈，我们也不知道是不是用的那个。。
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22楼2012-11-21 10:46:29
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
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15楼: Originally posted by zhoumin1108 at 2012-11-14 13:53:46
做点突变根本不需要kit,也不需要PCR全长质粒,用overlapPCR直接PCR突变基因就可以了,还不需要dpnI酶切.

听不懂。。
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23楼2012-11-21 10:46:53
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天蛇2012

新虫 (初入文坛)
你可以考虑分段克隆，在连接
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24楼2012-11-21 10:47:17
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
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17楼: Originally posted by linxt2005 at 2012-11-16 15:59:37
直接扩也是可行的，不过需要使用强悍一点的聚合酶，PCR然后DpnI，再然后转化就可以了。聚合酶用过一款叫Phusion的不错。
overlap也是可行的，
T载体也不赖，就是还都要酶切连接，比较麻烦。

嗯嗯，有人也介绍OVERLAP，但是不是很明白其中的做法呢，哎。。。
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25楼2012-11-21 10:48:27
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lxbxk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

两个T载体都可以，我做过最长为11K的点突变，用的TakaRa的Primestar，能P出来，一定注意的是循环数最好不要超过18个，我一般都是用16个循环，你可以尝试一下，祝你好运1
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做开心的自己，加油
26楼2012-11-21 10:56:54
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lxbxk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

两个T载体都可以，我做过最长为11K的点突变，用的TakaRa的Primestar，能P出来，一定注意的是循环数最好不要超过18个，我一般都是用16个循环，你可以尝试一下，祝你好运1
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做开心的自己，加油
27楼2012-11-21 10:57:21
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
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27楼: Originally posted by lxbxk at 2012-11-21 10:57:21
两个T载体都可以，我做过最长为11K的点突变，用的TakaRa的Primestar，能P出来，一定注意的是循环数最好不要超过18个，我一般都是用16个循环，你可以尝试一下，祝你好运1

额，不要很大的循环?我的全式金的上面显示要做起码25个循环呢....TAKARA的好用么？做出来了哈？
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28楼2012-11-21 11:08:33
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lxbxk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

嗯，必须要循环数少一些，我做过相关的实验，18个以上基本上P不出来的，我的做出来了呀，屡试不爽，呵呵，你可以试试的
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做开心的自己，加油
29楼2012-11-21 11:18:03
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
29楼: Originally posted by lxbxk at 2012-11-21 11:18:03
嗯，必须要循环数少一些，我做过相关的实验，18个以上基本上P不出来的，我的做出来了呀，屡试不爽，呵呵，你可以试试的

嗯嗯，因为我用的是全式金的，上面写的是25个循环，也不知道跟产品是不是相关，我再试试看看，如果25的循环数还P不出来的话我就降低循环数看看，你那个takara的试剂盒上面建议的是多少循环啊？
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30楼2012-11-21 12:04:33
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