24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 1908  |  回复: 31

sarah-miao

银虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-13 13:50:52
一般都在T载体上做好了,测序正确了再导入目的载体,你直接在目的载体上做,12 K是蛮大的,延伸时间12 min,是很难PCR出来的。希望对您有用。...

嗯嗯,听了您的建议给连到19T上去了,现在准备在19T上做突变,突变成功测序后在连回到目的载体上,万分感谢哈,不过我想问问一般做定点突变用哪家的试剂盒比较好啊?再次感谢啦
21楼2012-11-21 10:44:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)

引用回帖:
14楼: Originally posted by timmychina at 2012-11-14 12:08:47
也是全式金的  FM111...

哦哦,我看看哈,我们也不知道是不是用的那个。。
22楼2012-11-21 10:46:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by zhoumin1108 at 2012-11-14 13:53:46
做点突变根本不需要kit,也不需要PCR全长质粒,用overlapPCR直接PCR突变基因就可以了,还不需要dpnI酶切.

听不懂。。
23楼2012-11-21 10:46:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天蛇2012

新虫 (初入文坛)

你可以考虑分段克隆,在连接
24楼2012-11-21 10:47:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by linxt2005 at 2012-11-16 15:59:37
直接扩也是可行的,不过需要使用强悍一点的聚合酶,PCR然后DpnI,再然后转化就可以了。聚合酶用过一款叫Phusion的不错。
overlap也是可行的,
T载体也不赖,就是还都要酶切连接,比较麻烦。

嗯嗯,有人也介绍OVERLAP,但是不是很明白其中的做法呢,哎。。。
25楼2012-11-21 10:48:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lxbxk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

两个T载体都可以,我做过最长为11K的点突变,用的TakaRa的Primestar,能P出来,一定注意的是循环数最好不要超过18个,我一般都是用16个循环,你可以尝试一下,祝你好运1
做开心的自己,加油
26楼2012-11-21 10:56:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lxbxk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

两个T载体都可以,我做过最长为11K的点突变,用的TakaRa的Primestar,能P出来,一定注意的是循环数最好不要超过18个,我一般都是用16个循环,你可以尝试一下,祝你好运1
做开心的自己,加油
27楼2012-11-21 10:57:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)

引用回帖:
27楼: Originally posted by lxbxk at 2012-11-21 10:57:21
两个T载体都可以,我做过最长为11K的点突变,用的TakaRa的Primestar,能P出来,一定注意的是循环数最好不要超过18个,我一般都是用16个循环,你可以尝试一下,祝你好运1

额,不要很大的循环?我的全式金的上面显示要做起码25个循环呢....TAKARA的好用么?做出来了哈?
28楼2012-11-21 11:08:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lxbxk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

嗯,必须要循环数少一些,我做过相关的实验,18个以上基本上P不出来的,我的做出来了呀,屡试不爽,呵呵,你可以试试的
做开心的自己,加油
29楼2012-11-21 11:18:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)

引用回帖:
29楼: Originally posted by lxbxk at 2012-11-21 11:18:03
嗯,必须要循环数少一些,我做过相关的实验,18个以上基本上P不出来的,我的做出来了呀,屡试不爽,呵呵,你可以试试的

嗯嗯,因为我用的是全式金的,上面写的是25个循环,也不知道跟产品是不是相关,我再试试看看,如果25的循环数还P不出来的话我就降低循环数看看,你那个takara的试剂盒上面建议的是多少循环啊?
30楼2012-11-21 12:04:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 sarah-miao 的主题更新
信息提示
请填处理意见