应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 亲们，你们做定点突变么？
321/4返回列表1234下一页
查看: 2386  |  回复: 31
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

sarah-miao

银虫 (正式写手)

[求助] 亲们，你们做定点突变么？

最近在做定点突变，用的trans的定点突变的试剂盒，但是就是没有条带，我是希望在病毒基因组全场位置上突变两个碱基，有做过的人，能稍微知道下么，病毒基因组加上质粒载体一共12k,trans公司的人说可能是由于模板比较大的原因，你们做定点突变都是怎么做的，有什么经验能分享么，每次PCR都是P不出来，快郁闷死了。。。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2012-11-10 17:45:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhoumin1108

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

做点突变根本不需要kit,也不需要PCR全长质粒,用overlapPCR直接PCR突变基因就可以了,还不需要dpnI酶切.
赞一下(1人) 回复此楼
15楼2012-11-14 13:53:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

liuan6126

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议在T载体上突变好了再连目标载体，载体太大了，PCR不大容易
赞一下 回复此楼
2楼2012-11-11 11:14:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

polepolar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 编辑内容 2013-05-29 19:30
确实是因为模板太大的原因,现有的聚合酶扩增不了这么大的片段,建议交给公司做吧

[ Last edited by gyesang on 2013-5-29 at 19:30 ]
赞一下 回复此楼
北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
3楼2012-11-12 14:29:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-11 11:14:58
建议在T载体上突变好了再连目标载体，载体太大了，PCR不大容易

在T载体上做好突变？这样子是不是比较容易？你之前有做过么，有成功的例子没？
赞一下 回复此楼
4楼2012-11-12 15:54:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by polepolar at 2012-11-12 14:29:44
确实是因为模板太大的原因,现有的聚合酶扩增不了这么大的片段,建议交给公司做吧,可以关注一下北京普尔普乐生物技术有限公司.

额。。。。那你们公司用怎样的聚合酶，为什么能够进行如此之大的扩增变异呢？
赞一下 回复此楼
5楼2012-11-12 15:55:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

polepolar

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-12 15:55:12
额。。。。那你们公司用怎样的聚合酶，为什么能够进行如此之大的扩增变异呢？...

我们的做法与点突变试剂盒的做法不一样,是采用其它的策略,所以对于很长的序列我们也可以进行定点突变.
赞一下 回复此楼
北京普尔普乐生物技术有限公司(www.polepolar.com)
6楼2012-11-12 17:37:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

timmychina

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-14 16:37:11
我最近正在做全质粒定点突变，我的重组质粒是7kb,还是比较容易得到产物。
如果确定你是质粒太大的原因而不是PCR各种条件的因素，那么就换一种方法吧。貌似有种试剂盒是进行突变点区域小片段的置换进行突变的，可以搜搜。
赞一下 回复此楼
彩云之南的愿望还能实现吗
7楼2012-11-12 19:48:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangtaodluf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
片段太长的话一是不好P出来，二是保真上也不好说。可以尝试用OVERLAP PCR来做定点突变。
赞一下 回复此楼
8楼2012-11-13 08:43:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuan6126

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by sarah-miao at 2012-11-12 15:54:32
在T载体上做好突变？这样子是不是比较容易？你之前有做过么，有成功的例子没？...

一般都在T载体上做好了，测序正确了再导入目的载体，你直接在目的载体上做，12 K是蛮大的，延伸时间12 min，是很难PCR出来的。希望对您有用。
赞一下 回复此楼
9楼2012-11-13 13:50:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-13 13:50:52
一般都在T载体上做好了，测序正确了再导入目的载体，你直接在目的载体上做，12 K是蛮大的，延伸时间12 min，是很难PCR出来的。希望对您有用。...

谢谢啦，准备中，打算把需要突变的部分连上19T ，然后在酶切连到我的目的载体上，尝试下吧，看看能不能成功。另外你之前做过没，T载体的选择，我们实验室有19T还厚promega的PGEM-TEasy,哪个载体比较好做呢？
赞一下 回复此楼
10楼2012-11-13 16:46:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 sarah-miao 的主题更新
321/4返回列表1234下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 9/450 2026-08-23 03:04 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 11/550 2026-08-23 02:55 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +11 羊腰板 2026-08-21 11/550 2026-08-22 22:03 by lsbin3733
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +3 简单化xn 2026-08-22 7/350 2026-08-22 19:46 by 简单化xn
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 4/200 2026-08-22 16:52 by sunzitan
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+4 snowwithsea 2026-08-19 14/700 2026-08-21 23:51 by cratir
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +11 大萍1987 2026-08-20 13/650 2026-08-21 14:48 by 20120902066
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭