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zcf1990

银虫 (初入文坛)

[求助] PCR定点突变遇到问题 已有3人参与

亲们，我在做定点突变，但是碰到了以下问题；看哪位高手有没有碰到我这种情况：
我的PCR整个过程没有问题，克隆也能顺利长出；测序后与正向引物比对发现以下问题,就是引物比对是对的，引物之前的碱基也是对的，该突变的位点也是对的；但是在引物最后的碱基又接了一段一模一样的引物片段，等于重复了一模一样的引物长度；在重复的引物片段又能接上模板之后的序列；该种情况不止出现一次；求解~~~
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1楼 2013-06-13 20:47:19
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
扩增完了你切胶回收的吗？会不会是连接进去的？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-06-14 08:16:53
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zcf1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2013-06-14 08:16:53
扩增完了你切胶回收的吗？会不会是连接进去的？

我单纯的做定点突变，不需要胶回收；扩增完了，直接用DPnI去甲基化后转化~~
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3楼2013-06-14 08:23:02
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水花微谢

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
减少引物浓度试试
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4楼2013-06-14 12:31:32
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zcf1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 水花微谢 at 2013-06-14 12:31:32
减少引物浓度试试

请问你有碰到过这种情况吗？我分析不出到底是PCR中哪里出了问题~~
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5楼2013-06-14 12:40:29
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A_there

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2013-06-14 08:16:53
扩增完了你切胶回收的吗？会不会是连接进去的？

我切胶回收后也出现楼主的情况了 请问你知道为什么会连进去吗？
谢谢~
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6楼2013-10-25 08:50:01
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junefan7896

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也出现了这样的情况，可能的原因有两个，引物的质量不行，用HPSF的活HPLC纯化的引物试试，另外我剪短了退火时间，就只有一个repeat了
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7楼2014-11-20 22:52:02
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花散夕阳

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

再挑一个试试，不行就重p，我今天遇到了一样的问题，6个点突变，其中竟然就有两个是这样的问题
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8楼2015-12-10 19:24:00
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zl2670053160

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 花散夕阳 at 2015-12-10 19:24:00
再挑一个试试，不行就重p，我今天遇到了一样的问题，6个点突变，其中竟然就有两个是这样的问题

最近我也在做这部分工作，遇到了点麻烦，想要和前辈们问问。望不吝赐教。
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9楼2016-07-11 11:44:07
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zl2670053160

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

最近做这方面的内容，点突变遇到了点问题，望请教
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10楼2016-07-11 11:46:24
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