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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 删除几个核苷酸用质粒扩增诱变可以吗？
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天湖酒

新虫 (初入文坛)

[求助] 删除几个核苷酸用质粒扩增诱变可以吗？ 已有3人参与

我看到质粒扩增诱变基本是做把一个点变成另一个，我想要删掉几个核苷酸，也就编码4~5个氨基酸的长度，是不是引物设计的时候去掉就可以了，还是以删除的位点为中心设计引物吗？
除了这个方法，还有什么简单的方法可以做到定点除去一个片段？
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1楼 2014-04-01 16:28:59
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-01 17:54:08
设计引物时，序列为要删的氨基酸两端的序列就行。相当于把部分碱基截去。
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2楼2014-04-01 16:51:56
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天湖酒

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihe131 at 2014-04-01 16:51:56
设计引物时，序列为要删的氨基酸两端的序列就行。相当于把部分碱基截去。

那删除位点两端取的引物长度是不是差不多？引物还是要互补的一对吧？

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-04-01 20:29:46
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天湖酒 at 2014-04-01 20:29:46
那删除位点两端取的引物长度是不是差不多？引物还是要互补的一对吧？
...

不全是。你查一下quick change的方法吧。
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4楼2014-04-01 23:31:19
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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天湖酒(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-02 09:45:56
可以做一个Over-lap PCR设计引物去除这几个碱基。
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hehe
5楼2014-04-02 08:47:20
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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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天湖酒(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-04-02 09:46:23
看你的回复，应该是在用基于甲基化降解(DpnI)的突变试剂盒
这种试剂盒设计引物的时候要完全互补，扩展之后加入DpnI，降解模板
你注意看一下说明书吧，删除碱基的引物设计应该也是把删除的片段置于引物中间
不过一次4-5个碱基会造成突变效率下降的

还有一类突变试剂盒是PCR后再连接的，引物设计是邻接的，连接之后是一个完整的质粒。
这样的试剂盒，做删除突变就比较容易，而且也没有碱基长度的限制，不过要求引物合成的时候5‘磷酸化
同时需要有一个能扩增长片段的高保真酶

如果没有试剂盒，也没有能扩增长片段的高保真酶，那么你可以在要删除位点附近，寻找单酶切位点，然后像做重组克隆一样，把质粒双酶切，然后再连入删除了碱基的序列（这个可能要用到OverlapPCR）
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6楼2014-04-02 09:37:43
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