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前路知己

木虫 (正式写手)

[求助] 扩增条带很弱,该怎么解决呢 已有2人参与

最近PCR扩增了一个1800bp左右的片段,52℃杂带一堆,54℃比较特异了,但是经过30个循环还是条带很弱,下图是与400bp片段的对比,我是72℃延伸1min,求助高手如何解决?是不是需要增加循环数呢?谢谢!
扩增条带很弱,该怎么解决呢
注:前四个泳道是用的不同浓度DNA,54℃的扩增结果,泳道5是其它400bp的对照
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
前路知己: 金币+2, 有帮助, 非常感谢,马上开始试验 2014-04-09 11:50:29
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-09 14:18:58
以你的第二个泳道的产物为模板,退火温度设到58度,延长照样1min,循环到32个,再做一次PCR,模板加1ul就可以了。
2楼2014-04-09 11:00:56
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
问题可能有几个原因:
1.PCR温度不合适,适当调整
2.模版本身的浓度或者说质量是否可以
3.一般30个循环是可以的
4.对于延伸时间,我觉得应该没问题,或者适当长一些
5.还需要注意,在PCR加样的过程中,药品的量是否合理,是否加的正确
3楼2014-04-09 21:04:50
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