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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » RNA纯度是否会影响RT-PCR的结果
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963979587

银虫 (初入文坛)

[求助] RNA纯度是否会影响RT-PCR的结果 已有4人参与

各位虫友们，大家好，我提取的RNA,OD260/OD230都小于1可以用来做RT-PCR吗？影响大不大？
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1楼 2014-03-14 20:16:37
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朱多龙

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
963979587(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-15 10:43:31
很难说浓度多高就能反转成功，当然浓度越高可能效果越好。我的经验是只要有明显的RNA条带，我就可以反转，效果还不错。要是条带很弥散还是不要反转了。
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2楼2014-03-14 21:56:26
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bailihu01

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
3楼2014-03-15 01:20:09
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-15 10:43:47
尽量把质量提高些，若反转还好些，做定量那就不好用了。
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hehe
4楼2014-03-15 08:14:50
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963979587

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 朱多龙 at 2014-03-14 21:56:26
很难说浓度多高就能反转成功，当然浓度越高可能效果越好。我的经验是只要有明显的RNA条带，我就可以反转，效果还不错。要是条带很弥散还是不要反转了。

不做电泳可以吗？
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5楼2014-03-16 21:33:31
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963979587

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bailihu01 at 2014-03-15 01:20:09
会不会芬类物质浓度过高！！可能影响反转录结果

有可能，有时候洗了两遍，还是有的结果小于1
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6楼2014-03-16 21:34:15
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963979587

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-15 08:14:50
尽量把质量提高些，若反转还好些，做定量那就不好用了。

唉，我就是要做荧光定量，不知道影响会不会很大？
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7楼2014-03-16 21:35:00
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若溪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人经验，260/230偏小的话，那就是提取的时候有机试剂有残留，提取时可以改进以下几点：
1.加氯仿抽提后取少一点上清，不要贪多。
2.加乙醇洗的时候，多晃几次，尽量让RNA沉淀整片悬浮起来（有时候确实浮不起来也没办法。）
3.弃乙醇的时候，用枪吸而不是倾倒，倒的话经常有液滴留在管壁上，倒不干净。第一次用蓝枪头吸，可以不完全吸干，免得吸到沉淀；然后短暂离心把残余酒精甩到管底，看准了用白枪头尽量吸干净。RNA量大，被白枪头弄掉一点也没关系。
4.溶解前晾干的时间可以长一点，5分钟也没关系的。标准的做法说是不能晾太久，等沉淀开始变透明就要加水溶解，但是我晾过10分钟的，后面RNA量也很大。可能量大，虽然有些溶解不了，最后浓度还是高。
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没有比脚更长的路，没有比人更高的山
8楼2014-03-17 09:12:37
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963979587

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 若溪 at 2014-03-17 09:12:37
个人经验，260/230偏小的话，那就是提取的时候有机试剂有残留，提取时可以改进以下几点：
1.加氯仿抽提后取少一点上清，不要贪多。
2.加乙醇洗的时候，多晃几次，尽量让RNA沉淀整片悬浮起来（有时候确实浮不起来也 ...

谢谢哈，挺有用的
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9楼2014-03-23 20:51:31
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匿名

用户注销 (正式写手)

Thomas_HT
本帖仅楼主可见
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10楼2014-08-20 14:49:33
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