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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请问RT-PCR的过程会产生插入、缺失、突变等情况吗？
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shenxing325

铜虫 (小有名气)

[求助] 请问RT-PCR的过程会产生插入、缺失、突变等情况吗？

跟各位请教一下：
    第一次提RNA做RT-PCR，反转录用的酶是promega的M-MLV，PCR用的酶是Takara的高保真酶PrimeSTAR，然后用rTag酶72度处理了30min加A尾，最后转进T载体里面。如图所示，是T载体转化后的菌落PCR图，感觉几个条带的位置都稍有差异，所以选取了3、4、5三个较浓、大小有代表性的菌落摇菌然后测序。过程大致就是这样。
    结果让我奇怪的是这三个里面只有一个是我要的目的基因（5号），另外两个，其中一个（3号）发生了一些插入和缺失，有一大段和模板比对本来应该是在偏上游的位置，结果整段缺失，在偏下游的位置却出现了，并且多出了一个碱基，导致后面的序列都移码了；另外一个（4号）更加奇怪，几乎没有完整的orf除了上游引物部分对得上，后面的就完全不是我要的东西了，在NCBI上blast了一下，只有一个序列约有60%不到的碱基能比对得上，是属于比较近源的物种里面的。
    我想弄明白的是，这两段奇怪序列是从哪里来的，是在反转录的时候发生的插入、缺失和突变吗？为何还能得到我本来想要的序列？有劳各位！

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1楼 2012-10-15 10:24:29
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
木有回复，自己顶一个吧。。。
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2楼2012-10-15 15:08:31
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晨钟暮鼓w

金虫 (小有名气)
我觉得可能是你序列的问题的，我以前克隆TATAbox的时候有过这种情况，测序总不准，一般应该不能出现突变，不然就测序也就没有意义了，建议你换换试剂再做一遍试试
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水花起处，我心凄然
3楼2012-10-15 15:56:03
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晨钟暮鼓w at 2012-10-15 15:56:03
我觉得可能是你序列的问题的，我以前克隆TATAbox的时候有过这种情况，测序总不准，一般应该不能出现突变，不然就测序也就没有意义了，建议你换换试剂再做一遍试试

我这里不是测不准，我换了两家公司测序，结果是一样的。因为之前对反转录不熟，所以要先排除是反转录的问题。在连接T载体之前，PCR产物看起来都挺亮挺窄的，不像是有几条条带夹在一起的样子。
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4楼2012-10-15 16:28:21
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
还是木有人，再顶一下
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5楼2012-10-15 21:35:02
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 晨钟暮鼓w at 2012-10-15 15:56:03
我觉得可能是你序列的问题的，我以前克隆TATAbox的时候有过这种情况，测序总不准，一般应该不能出现突变，不然就测序也就没有意义了，建议你换换试剂再做一遍试试

只有你一个回复，谢谢啦
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6楼2012-10-18 10:05:30
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晨钟暮鼓w

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by shenxing325 at 2012-10-18 10:05:30
只有你一个回复，谢谢啦...

再帮你顶一下吧
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shenxing325
水花起处，我心凄然
7楼2012-10-18 10:10:21
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by 晨钟暮鼓w at 2012-10-18 10:10:21
再帮你顶一下吧...

谢谢。。。已经关闭了，多谢啦
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8楼2012-10-19 20:03:46
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