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shenxing325

铜虫 (小有名气)

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专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 请问RT-PCR的过程会产生插入、缺失、突变等情况吗？

跟各位请教一下：
第一次提RNA做RT-PCR，反转录用的酶是promega的M-MLV，PCR用的酶是Takara的高保真酶PrimeSTAR，然后用rTag酶72度处理了30min加A尾，最后转进T载体里面。如图所示，是T载体转化后的菌落PCR图，感觉几个条带的位置都稍有差异，所以选取了3、4、5三个较浓、大小有代表性的菌落摇菌然后测序。过程大致就是这样。
结果让我奇怪的是这三个里面只有一个是我要的目的基因（5号），另外两个，其中一个（3号）发生了一些插入和缺失，有一大段和模板比对本来应该是在偏上游的位置，结果整段缺失，在偏下游的位置却出现了，并且多出了一个碱基，导致后面的序列都移码了；另外一个（4号）更加奇怪，几乎没有完整的orf除了上游引物部分对得上，后面的就完全不是我要的东西了，在NCBI上blast了一下，只有一个序列约有60%不到的碱基能比对得上，是属于比较近源的物种里面的。
我想弄明白的是，这两段奇怪序列是从哪里来的，是在反转录的时候发生的插入、缺失和突变吗？为何还能得到我本来想要的序列？有劳各位！

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