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请问qRT-PCR的标准曲线中扩增效率过高是怎么回事 已有3人参与
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我在做4个目的基因和一个内参基因qRT-PCR的标准曲线时，扩增效率全部都超过了120%，最高的甚至达到190%。我现在唯一能确定的就是在加样的过程中不同稀释梯度（10倍的梯度）的模板cDNA在加样过程中有相互污染，所以Ct值也不成线性的变化。我现在就是再重新做并严格避免污染，但是除了我确定的这个原因，还有其他的一些什么原因可能导致了扩增效率过高呢？ 请有经验的高手指教，非常谢谢！ 还有一个问题，就是我的内参基因本身的丰度比其他4个目的基因的高很多，因为即使模板稀释了10^5倍了，但Ct值也没有超过20，而其他的目的基因的Ct值都在24到31之间，这种内参基因和目的基因本身的丰度悬殊这么大，这样的内参可以用来作为内参吗？是不是找一个与目的基因相当的才行呢？感谢解惑！ |
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lvbobo823
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3楼2014-02-25 20:25:58
atlanticwi
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-26 08:20:53
wybiology: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-03-01 15:23:56
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wybiology: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-03-01 15:23:56
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... 1. 引物不合适，不仅仅有扩增效率不够100%的情况出现，同样也有扩增效率超过100%的情况，普通认为90~110%的扩增效率比较合适。你的扩增效率过高，你需要在引物上下下工夫。 2. 这样的内参肯定不合适，内参有很多，建议第一次做的时候，多上几个内参（3个左右）一起看看比较合适。 祝实验顺利，说的不周之处希望高手指点  |
2楼2014-02-25 20:22:54
4楼2014-02-25 22:33:54
5楼2014-02-26 15:28:00
