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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR扩增结果
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文飞778899

银虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增结果 已有4人参与

亲们，帮我看下这图片，没有条带，只是在加样口有少许亮带，这亮带是什么呢？谢谢～～P了好多次，酶也换了，模板也一直重提，体系也试了好几种，就是这结果，真心难过！
PCR扩增结果
F3.jpg
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1楼 2014-01-03 19:51:11
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-04 00:25:20
大部分原因可能是模板问题
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3楼2014-01-03 20:28:00
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普通回帖

gyl121

新虫 (正式写手)
怎么没有人回答呢？我也是这个问题，这两天做这个实验，DNA别的引物都可以扩增出条带，就这个引物不靠谱，我都累了； 所以，我觉得不是DNA模板的原因，点样孔部分出现特别亮（我的实验）我觉得DNA浓度高了，可是稀释了5,10倍结果没多大变化，所以认为是浓度不合适，希望与楼主交流下意见
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不经一番寒彻骨，怎得梅花扑鼻香？为科学进步不懈努力
2楼2014-01-03 20:00:49
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紫色的刺客

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-04 00:25:29
这个明显没结果，建议你先用别人报道过的基因引物做个阳性对照，如果阳性对照都没跑出来，那就是模板有问题，如果阳性对照有结果，就是你这个引物问题，建议做个温度梯度
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4楼2014-01-03 20:54:59
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-04 00:25:42
文飞778899: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-01-04 12:00:26
从你的电泳结果来看，可以得出一下结论：
1：有引物二聚体，说明你应该是没有犯低级错误
2：加样孔有亮的条带，说明可能是较大的DNA 为跑出（一般情况不会），再者就是你提取的基因组或者是质粒含有蛋白质等其他杂志
3：泳道有很明显的弥散现象，说明你的模板里面的DNA降解非常严重，建议考虑一下你的模板的质量问题
4：退火温度太高，核对一下你的PCR程序以及Tm值
5：dNTP有问题，可以更换PCR体系中的dNTP以及buffer
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5楼2014-01-03 21:30:51
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是点样没有点好，胶没配好。
还有可能是退火温度还可以优化，可以试着温度多降低几度。
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6楼2014-01-03 21:55:47
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文飞778899

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by shiliyusly at 2014-01-03 21:55:47
可能是点样没有点好，胶没配好。
还有可能是退火温度还可以优化，可以试着温度多降低几度。

谢谢，嗯，我跑个梯度看看
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7楼2014-01-04 11:59:56
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文飞778899

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 20083630zhan at 2014-01-03 21:30:51
从你的电泳结果来看，可以得出一下结论：
1：有引物二聚体，说明你应该是没有犯低级错误
2：加样孔有亮的条带，说明可能是较大的DNA 为跑出（一般情况不会），再者就是你提取的基因组或者是质粒含有蛋白质等其他杂 ...

这组引物也是引用别人文献的，退火温度先按文献说明跑了没有，后来我把退火温度降低了还是没有。
同样的模板，我昨晚用其它引物跑了下有带，但对照也有模糊带，今天再跑看看。
嗯，模板确实是粗提液，杂质比较多。
这组引物好多文献都用过，都说是最佳引物，怎么我就跑不出来，dNTP,buffer,用来跑其它的都能扩得出来的呀。
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8楼2014-01-04 12:09:07
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文飞778899

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 紫色的刺客 at 2014-01-03 20:54:59
这个明显没结果，建议你先用别人报道过的基因引物做个阳性对照，如果阳性对照都没跑出来，那就是模板有问题，如果阳性对照有结果，就是你这个引物问题，建议做个温度梯度

这对引物也是别人报道过，而且评价很高的。昨天跑其它一对引物，跑出来了，可是我想用的是这对引物啊，嗯，我跑个温度梯度吧，谢谢：）
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9楼2014-01-04 12:10:44
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文飞778899

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyl121 at 2014-01-03 20:00:49
怎么没有人回答呢？我也是这个问题，这两天做这个实验，DNA别的引物都可以扩增出条带，就这个引物不靠谱，我都累了； 所以，我觉得不是DNA模板的原因，点样孔部分出现特别亮（我的实验）我觉得DNA浓度高了，可是稀释 ...

每一个因素都再试一遍吧
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10楼2014-01-04 12:11:36
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