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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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文飞778899

银虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增结果 已有4人参与

亲们,帮我看下这图片,没有条带,只是在加样口有少许亮带,这亮带是什么呢?谢谢~~P了好多次,酶也换了,模板也一直重提,体系也试了好几种,就是这结果,真心难过!
PCR扩增结果
F3.jpg
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lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-04 00:25:20
大部分原因可能是模板问题
3楼2014-01-03 20:28:00
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普通回帖

gyl121

新虫 (正式写手)

怎么没有人回答呢?我也是这个问题,这两天做这个实验,DNA别的引物都可以扩增出条带,就这个引物不靠谱,我都累了; 所以,我觉得不是DNA模板的原因,点样孔部分出现特别亮(我的实验)我觉得DNA浓度高了,可是稀释了5,10倍结果没多大变化,所以认为是浓度不合适,希望与楼主交流下意见
不经一番寒彻骨,怎得梅花扑鼻香?为科学进步不懈努力
2楼2014-01-03 20:00:49
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紫色的刺客

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-04 00:25:29
这个明显没结果,建议你先用别人报道过的基因引物做个阳性对照,如果阳性对照都没跑出来,那就是模板有问题,如果阳性对照有结果,就是你这个引物问题,建议做个温度梯度
4楼2014-01-03 20:54:59
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-04 00:25:42
文飞778899: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-01-04 12:00:26
从你的电泳结果来看,可以得出一下结论:
1:有引物二聚体,说明你应该是没有犯低级错误
2:加样孔有亮的条带,说明可能是较大的DNA 为跑出(一般情况不会),再者就是你提取的基因组或者是质粒含有蛋白质等其他杂志
3:泳道有很明显的弥散现象,说明你的模板里面的DNA降解非常严重,建议考虑一下你的模板的质量问题
4:退火温度太高,核对一下你的PCR程序以及Tm值
5:dNTP有问题,可以更换PCR体系中的dNTP以及buffer
5楼2014-01-03 21:30:51
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能是点样没有点好,胶没配好。
还有可能是退火温度还可以优化,可以试着温度多降低几度。
6楼2014-01-03 21:55:47
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文飞778899

银虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by shiliyusly at 2014-01-03 21:55:47
可能是点样没有点好,胶没配好。
还有可能是退火温度还可以优化,可以试着温度多降低几度。

谢谢,嗯,我跑个梯度看看
7楼2014-01-04 11:59:56
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文飞778899

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 20083630zhan at 2014-01-03 21:30:51
从你的电泳结果来看,可以得出一下结论:
1:有引物二聚体,说明你应该是没有犯低级错误
2:加样孔有亮的条带,说明可能是较大的DNA 为跑出(一般情况不会),再者就是你提取的基因组或者是质粒含有蛋白质等其他杂 ...

这组引物也是引用别人文献的,退火温度先按文献说明跑了没有,后来我把退火温度降低了还是没有。
同样的模板,我昨晚用其它引物跑了下有带,但对照也有模糊带,今天再跑看看。
嗯,模板确实是粗提液,杂质比较多。
这组引物好多文献都用过,都说是最佳引物,怎么我就跑不出来,dNTP,buffer,用来跑其它的都能扩得出来的呀。
8楼2014-01-04 12:09:07
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文飞778899

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 紫色的刺客 at 2014-01-03 20:54:59
这个明显没结果,建议你先用别人报道过的基因引物做个阳性对照,如果阳性对照都没跑出来,那就是模板有问题,如果阳性对照有结果,就是你这个引物问题,建议做个温度梯度

这对引物也是别人报道过,而且评价很高的。昨天跑其它一对引物,跑出来了,可是我想用的是这对引物啊,嗯,我跑个温度梯度吧,谢谢:)
9楼2014-01-04 12:10:44
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文飞778899

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyl121 at 2014-01-03 20:00:49
怎么没有人回答呢?我也是这个问题,这两天做这个实验,DNA别的引物都可以扩增出条带,就这个引物不靠谱,我都累了; 所以,我觉得不是DNA模板的原因,点样孔部分出现特别亮(我的实验)我觉得DNA浓度高了,可是稀释 ...

每一个因素都再试一遍吧
10楼2014-01-04 12:11:36
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