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kongzhen1985

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于双酶切的酶的失活问题 已有4人参与

最近实验要用到EcoRI和KpnI进行双酶切,且酶切以后需要进行后续的连接反应,EcoRI可以采用热失活灭活,但是KpnI在网上搜索发现不能热失活,想问下有做过这方面的能帮分析下吗?谢谢啦!!还有这两个酶进行双酶切过夜可以吗?
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lillian菲

银虫 (小有名气)

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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-25 12:19:48
做完酶切必须要纯化一下,因为酶切会引入一些离子,影响下面实验,且纯化一下可以让酶失活,不用热失活,这不是一举两得嘛。纯化虽然会损失一部分,但对下面实验还是有利的,否则你的实验后面出现问题你都不知道咋回事。还是每一步都做好最好了,这样不会出现问题。
还有酶切最好不要过夜切,大概一两个小时就可以了。你用的酶我都用过,很好用,推荐你用fermentas公司的,酶都很好用,又便宜。
6楼2013-12-24 10:05:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-24 00:22:41
通常做完酶切最好回收纯化后再做连接。KpnI可以通过纯化回收步骤失活。虽然各个公司的酶稍有不同,公司的说明书上会有这方面的信息。据我的经验,这两个酶通常是可以切过夜的。
2楼2013-12-23 23:36:25
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luwei13566

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-24 08:24:15
双酶切后可以跑胶后割胶回收的方法进行纯化,回收后所有的酶全部除去~~,如果想过夜双酶切首先要看看两个酶的说明书确定两个酶的酶切buffer是否兼容,用不太兼容的buffer长时间酶切可能会诱发star活性~~,
大家相互帮助哈
3楼2013-12-24 00:30:13
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sxxuan

金虫 (著名写手)

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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-24 12:10:04
很少主动地灭活酶
一来是纯化的时候可以去除,二来如果割胶的话加入电泳buffer也可以把酶失活的
你的日子如何,你的力量也必如何!
4楼2013-12-24 09:26:16
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