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kongzhen1985

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于双酶切的酶的失活问题 已有4人参与

最近实验要用到EcoRI和KpnI进行双酶切,且酶切以后需要进行后续的连接反应,EcoRI可以采用热失活灭活,但是KpnI在网上搜索发现不能热失活,想问下有做过这方面的能帮分析下吗?谢谢啦!!还有这两个酶进行双酶切过夜可以吗?
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luwei13566

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-24 08:24:15
双酶切后可以跑胶后割胶回收的方法进行纯化,回收后所有的酶全部除去~~,如果想过夜双酶切首先要看看两个酶的说明书确定两个酶的酶切buffer是否兼容,用不太兼容的buffer长时间酶切可能会诱发star活性~~,
大家相互帮助哈
3楼2013-12-24 00:30:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-24 00:22:41
通常做完酶切最好回收纯化后再做连接。KpnI可以通过纯化回收步骤失活。虽然各个公司的酶稍有不同,公司的说明书上会有这方面的信息。据我的经验,这两个酶通常是可以切过夜的。
2楼2013-12-23 23:36:25
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sxxuan

金虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-24 12:10:04
很少主动地灭活酶
一来是纯化的时候可以去除,二来如果割胶的话加入电泳buffer也可以把酶失活的
你的日子如何,你的力量也必如何!
4楼2013-12-24 09:26:16
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kongzhen1985

新虫 (初入文坛)

因为我是要做重组酶方面的。说明书上是酶切完后直接热失活就可以用于重组反应,所以担心纯化后会损失一部分的,如果是这样那我还是回收一下吧,怕影响后续的重组反应,谢谢大家的帮忙了。还有有做重组方面的虫友能交流下吗?
5楼2013-12-24 09:52:12
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