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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于双酶切的酶的失活问题
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kongzhen1985

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于双酶切的酶的失活问题 已有4人参与

最近实验要用到EcoRI和KpnI进行双酶切，且酶切以后需要进行后续的连接反应，EcoRI可以采用热失活灭活，但是KpnI在网上搜索发现不能热失活，想问下有做过这方面的能帮分析下吗？谢谢啦!!还有这两个酶进行双酶切过夜可以吗？
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1楼 2013-12-23 22:42:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-24 00:22:41
通常做完酶切最好回收纯化后再做连接。KpnI可以通过纯化回收步骤失活。虽然各个公司的酶稍有不同，公司的说明书上会有这方面的信息。据我的经验，这两个酶通常是可以切过夜的。
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2楼2013-12-23 23:36:25
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-24 08:24:15
双酶切后可以跑胶后割胶回收的方法进行纯化，回收后所有的酶全部除去~~，如果想过夜双酶切首先要看看两个酶的说明书确定两个酶的酶切buffer是否兼容，用不太兼容的buffer长时间酶切可能会诱发star活性~~，
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大家相互帮助哈
3楼2013-12-24 00:30:13
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-24 12:10:04
很少主动地灭活酶
一来是纯化的时候可以去除，二来如果割胶的话加入电泳buffer也可以把酶失活的
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你的日子如何，你的力量也必如何！
4楼2013-12-24 09:26:16
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kongzhen1985

新虫 (初入文坛)
因为我是要做重组酶方面的。说明书上是酶切完后直接热失活就可以用于重组反应，所以担心纯化后会损失一部分的，如果是这样那我还是回收一下吧，怕影响后续的重组反应，谢谢大家的帮忙了。还有有做重组方面的虫友能交流下吗？
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5楼2013-12-24 09:52:12
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lillian菲

银虫 (小有名气)
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-25 12:19:48
做完酶切必须要纯化一下，因为酶切会引入一些离子，影响下面实验，且纯化一下可以让酶失活，不用热失活，这不是一举两得嘛。纯化虽然会损失一部分，但对下面实验还是有利的，否则你的实验后面出现问题你都不知道咋回事。还是每一步都做好最好了，这样不会出现问题。
还有酶切最好不要过夜切，大概一两个小时就可以了。你用的酶我都用过，很好用，推荐你用fermentas公司的，酶都很好用，又便宜。
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6楼2013-12-24 10:05:17
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kongzhen1985

新虫 (初入文坛)
恩，谢谢大家提的意见，我还是回收一下吧
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7楼2013-12-24 12:11:48
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