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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 这个条带是肿么个情况啊？是构建成功不？
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

[求助] 这个条带是肿么个情况啊？是构建成功不？ 已有1人参与

这个是肿么个情况啊？我的目的基因做PCR的时候，条带在500~600bp之间
Sal1和Xho1双酶切（间隔39bp）以后连接PLNCX2载体，转化后挑单菌落，菌摇起来以后制备模板，分别用目的基因引物（590bp）和载体引物（175bp）扩增，下方最亮的条带就是500bp的~~~~~~~~~实验室的SYBR显色效果越来越差啊，望见谅
为嘛目的基因扩出来的再500bp左右，载体在600bp左右了？这个是非特异吗？可是同样的，别的几个菌落为啥木有呢？
这个条带是肿么个情况啊？是构建成功不？
目的基因扩增.jpg


这个条带是肿么个情况啊？是构建成功不？-1
载体扩增.jpg
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努力打败一切
1楼 2013-12-23 19:42:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 20:26:13
引用回帖:
3楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-12-24 01:20:13
就是在酶切位点两侧的，那加上插入基因，不是应该增加的吗？嘿嘿，习惯的是这样双扩的。那我这种就是假阳性的喽？...

你用的什么marker?第一张marker看不清，第二张还可以看。从marker上估计大小不十分准确。我感觉最下面的是引物二聚体。PCR的效果不是很好，你可以试试挑阳性克隆提下质粒继续分析。
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4楼2013-12-24 01:32:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yangjingjing(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2013-12-24 08:23:31
说明一下你的载体上的引物175bp是怎么回事？菌落PCR鉴定时可能有假阳性，需要做阴性对照并做进一步鉴定。此外，两个引物最好是一个在目的基因上，一个在载体上，减少假阳性的几率。实在不行，你可以挑几个阳性克隆，提质粒做酶切鉴定。
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2楼2013-12-23 23:17:28
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yangjingjing

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-23 23:17:28
说明一下你的载体上的引物175bp是怎么回事？菌落PCR鉴定时可能有假阳性，需要做阴性对照并做进一步鉴定。此外，两个引物最好是一个在目的基因上，一个在载体上，减少假阳性的几率。实在不行，你可以挑几个阳性克隆， ...

就是在酶切位点两侧的，那加上插入基因，不是应该增加的吗？嘿嘿，习惯的是这样双扩的。那我这种就是假阳性的喽？
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努力打败一切
3楼2013-12-24 01:20:13
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