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yangjingjing

木虫 (正式写手)

[求助] 这个条带是肿么个情况啊?是构建成功不? 已有1人参与

这个是肿么个情况啊?我的目的基因做PCR的时候,条带在500~600bp之间
Sal1和Xho1双酶切(间隔39bp)以后连接PLNCX2载体,转化后挑单菌落,菌摇起来以后制备模板,分别用目的基因引物(590bp)和载体引物(175bp)扩增,下方最亮的条带就是500bp的~~~~~~~~~实验室的SYBR显色效果越来越差啊,望见谅
为嘛目的基因扩出来的再500bp左右,载体在600bp左右了?这个是非特异吗?可是同样的,别的几个菌落为啥木有呢?
这个条带是肿么个情况啊?是构建成功不?
目的基因扩增.jpg


这个条带是肿么个情况啊?是构建成功不?-1
载体扩增.jpg
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努力打败一切
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yangjingjing(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2013-12-24 08:23:31
说明一下你的载体上的引物175bp是怎么回事?菌落PCR鉴定时可能有假阳性,需要做阴性对照并做进一步鉴定。此外,两个引物最好是一个在目的基因上,一个在载体上,减少假阳性的几率。实在不行,你可以挑几个阳性克隆,提质粒做酶切鉴定。
2楼2013-12-23 23:17:28
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-23 23:17:28
说明一下你的载体上的引物175bp是怎么回事?菌落PCR鉴定时可能有假阳性,需要做阴性对照并做进一步鉴定。此外,两个引物最好是一个在目的基因上,一个在载体上,减少假阳性的几率。实在不行,你可以挑几个阳性克隆, ...

就是在酶切位点两侧的,那加上插入基因,不是应该增加的吗?嘿嘿,习惯的是这样双扩的。那我这种就是假阳性的喽?
努力打败一切
3楼2013-12-24 01:20:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2014-01-27 20:26:13
引用回帖:
3楼: Originally posted by yangjingjing at 2013-12-24 01:20:13
就是在酶切位点两侧的,那加上插入基因,不是应该增加的吗?嘿嘿,习惯的是这样双扩的。那我这种就是假阳性的喽?...

你用的什么marker?第一张marker看不清,第二张还可以看。从marker上估计大小不十分准确。我感觉最下面的是引物二聚体。PCR的效果不是很好,你可以试试挑阳性克隆提下质粒继续分析。
4楼2013-12-24 01:32:10
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