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奋斗不懈

银虫 (小有名气)

[求助] 克隆遇到测序的问题

本人最近在做一套克隆载体,需要接GFP和mcherry两个荧光蛋白,菌落pcr验证已经连到载体上,提质粒,酶切验证也正确,但是送测序后却测不出来, 测序的结果是‘ 测序后发现有重叠现象’。已经换过两个引物,还是出现同样的结果,不知道问题出在哪里,请大神们给指点迷津,在下不胜感激。
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
测序有重叠,是不是楼主的样品有污染?
jiayoubashaonian
2楼2013-12-03 16:26:43
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bolysu

禁虫 (著名写手)

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-03 20:27:17
本帖内容被屏蔽

3楼2013-12-03 18:15:01
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这种情况,可能是你的质粒不是单克隆,果断把你的质粒重新转化挑单克隆抽质粒再送测序
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-12-03 20:28:36
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奋斗不懈

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-03 20:28:36
这种情况,可能是你的质粒不是单克隆,果断把你的质粒重新转化挑单克隆抽质粒再送测序

已经重新转化再测,但结果还是一样,找不出原因,已经在从头开始了,不知道是不是还会出现这样的原因
5楼2013-12-04 16:33:48
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奋斗不懈

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by bolysu at 2013-12-03 18:15:01
你要比对下你的测序引物除了和载体结合外,是否还可以和目的基因结合。测序有重叠基本都是测序引物不合格,公司提供的所谓通用引物也不是万能的

我用的是目的基因(GFP和mcherry)上的引物,还用了启动子上的引物,测的结果都是重叠,不知是不是克隆出的问题,在重新做
6楼2013-12-04 16:37:41
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 奋斗不懈 at 2013-12-04 16:33:48
已经重新转化再测,但结果还是一样,找不出原因,已经在从头开始了,不知道是不是还会出现这样的原因...

还有你做的克隆是不是有多个引物结合位点?
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2013-12-04 18:19:37
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奋斗不懈

银虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-04 18:19:37
还有你做的克隆是不是有多个引物结合位点?...

换过一个引物了
8楼2013-12-04 20:29:19
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