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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RetroQ载体酶切条带问题
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

[求助] RetroQ载体酶切条带问题

请各位路过的大神帮忙分析下这个是什么情况啊，上图，左起是完整质粒（由于大孔跑胶，所以条带有点纠结，见谅哈~~）RetroQ完整长度是6445bp,酶切位点是BamH1和EcoR1，相差5bp，酶切一小时是现在的情况，两小时就完全糊掉的拖尾，根本看不到条带了~这个是什么情况啊？
酶切体系是两酶各0.5,质粒7ul（6ug），3ul 10*K buffer，30ul体系。
试着把那条亮的条带回收，连接1:3,1:10,10ul体系，转化，很少长菌，有时候长了，鉴定下也是假阳性的，都两个多月了，请大家帮忙分析下，谢谢啦！
RetroQ载体酶切条带问题
Administrator 2013-11-13 16hr 06min.jpg


RetroQ载体酶切条带问题-1
Administrator 2013-11-14 19hr 26min.jpg
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努力打败一切
1楼 2013-12-01 00:09:20
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yangjingjing(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-01 14:50:03
酶的量无需那么多
一般50ul体系里,
酶各0.5ul,
质粒2~5ug即可
酶切时间2~3小时
跑胶回收后,
正常连接,转化即可
.
赞一下 回复此楼
2楼2013-12-01 08:08:25
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yangjingjing

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2013-12-01 08:08:25
酶的量无需那么多
一般50ul体系里,
酶各0.5ul,
质粒2~5ug即可
酶切时间2~3小时
跑胶回收后,
正常连接,转化即可
.

可是两个小时就完全的拖尾，白的糊成一片了~~~那你能帮我分析下这个条带上面多出来的是什么吗？
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努力打败一切
3楼2013-12-01 13:09:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
切糊可能酶污染了。分别做单酶切2h，看看是哪个酶的问题。你的marker是1kb ladder吗？
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4楼2013-12-02 06:15:03
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yangjingjing

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-02 06:15:03
切糊可能酶污染了。分别做单酶切2h，看看是哪个酶的问题。你的marker是1kb ladder吗？

切两个小时就不行了，就完全拖尾了，换别的实验室的也是哦。是1KB的
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努力打败一切
5楼2013-12-02 13:30:52
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俞小淼

新虫 (初入文坛)
我也用的1kb的，切了两个小时和一个小时，分别跑了电泳，都有拖尾。以为是DEPC水有问题，结果不是

发自小木虫IOS客户端
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6楼2019-03-29 20:01:44
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