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yangjingjing

木虫 (正式写手)

[求助] RetroQ载体酶切条带问题

请各位路过的大神帮忙分析下这个是什么情况啊,上图,左起是完整质粒(由于大孔跑胶,所以条带有点纠结,见谅哈~~)RetroQ完整长度是6445bp,酶切位点是BamH1和EcoR1,相差5bp,酶切一小时是现在的情况,两小时就完全糊掉的拖尾,根本看不到条带了~这个是什么情况啊?
酶切体系是两酶各0.5,质粒7ul(6ug),3ul 10*K buffer,30ul体系。
试着把那条亮的条带回收,连接1:3,1:10,10ul体系,转化,很少长菌,有时候长了,鉴定下也是假阳性的,都两个多月了,请大家帮忙分析下,谢谢啦!
RetroQ载体酶切条带问题
Administrator 2013-11-13 16hr 06min.jpg


RetroQ载体酶切条带问题-1
Administrator 2013-11-14 19hr 26min.jpg
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努力打败一切
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
yangjingjing(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-12-01 14:50:03
酶的量无需那么多
一般50ul体系里,
酶各0.5ul,
质粒2~5ug即可
酶切时间2~3小时
跑胶回收后,
正常连接,转化即可
.
2楼2013-12-01 08:08:25
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2013-12-01 08:08:25
酶的量无需那么多
一般50ul体系里,
酶各0.5ul,
质粒2~5ug即可
酶切时间2~3小时
跑胶回收后,
正常连接,转化即可
.

可是两个小时就完全的拖尾,白的糊成一片了~~~那你能帮我分析下这个条带上面多出来的是什么吗?
努力打败一切
3楼2013-12-01 13:09:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
切糊可能酶污染了。分别做单酶切2h,看看是哪个酶的问题。你的marker是1kb ladder吗?
4楼2013-12-02 06:15:03
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-02 06:15:03
切糊可能酶污染了。分别做单酶切2h,看看是哪个酶的问题。你的marker是1kb ladder吗?

切两个小时就不行了,就完全拖尾了,换别的实验室的也是哦。是1KB的
努力打败一切
5楼2013-12-02 13:30:52
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俞小淼

新虫 (初入文坛)

我也用的1kb的,切了两个小时和一个小时,分别跑了电泳,都有拖尾。以为是DEPC水有问题,结果不是

发自小木虫IOS客户端
6楼2019-03-29 20:01:44
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