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lance-tan

金虫 (小有名气)

[求助] 细菌V3区扩增

RT..最近做的细菌V3区扩增想做下DGGE,但是非特异性条带一直很多,退火温度调节了好几次还是没很好的改善。能否请各位看下帮我解决一下
体系如下
2xmix 25ul  
338F 1ul  
518R 1ul
模板  1ul
ddH2O 补足 50ul  (模板为16S 的产物)
程序
94℃             5 min
94℃             5 min
65℃(-0.5℃)0.5 min    20cycle(第2-4步)     
72℃             3 min   
94℃             1 min
55℃            0.5min         10cycle(第5-7步)
72℃             3 min
72℃             10min
在下比较着急啊  请各位帮帮忙。。
细菌V3区扩增
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dllchina

木虫 (著名写手)

有机的微生物大神

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lance-tan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-05 13:11:50
lance-tan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-05 13:12:15
楼主,发个文档给你看看

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  • 附件 1 : 细菌16S_rDNA_V3区的PCR-DGGE分析.doc
  • 2013-11-05 12:30:18, 49 K
4楼2013-11-05 12:30:20
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zqp9110

金虫 (正式写手)

额,问题貌似还挺多
1.PCR反应各步骤的时间不需要那么长,长时间94℃对聚合酶活性有影响,V3区一共就150多bp,延伸时间30s足够。
2.环境样本用touchdown没错,但总体循环数可少一些,比如20个循环,可减少非特异。
3.建议上DGGE之前做一次re-conditioning PCR,对DGGE效果帮助很大。
4. 貌似你用的是巢式PCR?第一步16S全长的产物作为第二步V3扩增的模板?这样的话模板需要稀释100倍左右,不然量太大,会增加非特异。为何不尝试直接扩增V3区?
BEYOND
8楼2013-11-06 00:16:27
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普通回帖

lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
模板是提取的什么样品,感觉你第2-4步解链时间有点太长了吧,需要这么久解链嘛
2楼2013-11-05 10:56:00
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lance-tan

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lhf903 at 2013-11-05 10:56:00
模板是提取的什么样品,感觉你第2-4步解链时间有点太长了吧,需要这么久解链嘛

是土壤样品的总DNA,那需要怎么调整呢?
新手入门求各位大神指导
3楼2013-11-05 12:12:39
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lance-tan

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by dllchina at 2013-11-05 12:30:20
楼主,发个文档给你看看

谢谢 很有用。。
新手入门求各位大神指导
5楼2013-11-05 13:12:01
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lhf903

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by dllchina at 2013-11-05 12:30:20
楼主,发个文档给你看看

4楼的文档已经讲的差不多了,没什么大问题;我做细菌DGGE是V6区,V3目标条带是200bp,NCBI好像现在不接受200bp以下的序列了吧
6楼2013-11-05 21:42:05
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cjlovesen

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by lhf903 at 2013-11-05 21:42:05
4楼的文档已经讲的差不多了,没什么大问题;我做细菌DGGE是V6区,V3目标条带是200bp,NCBI好像现在不接受200bp以下的序列了吧...

没问题的,还是可以的
做就做最好的
7楼2013-11-05 22:16:50
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快乐小托儿

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zqp9110 at 2013-11-06 00:16:27
额,问题貌似还挺多
1.PCR反应各步骤的时间不需要那么长,长时间94℃对聚合酶活性有影响,V3区一共就150多bp,延伸时间30s足够。
2.环境样本用touchdown没错,但总体循环数可少一些,比如20个循环,可减少非特异。 ...

请问re-conditioning PCR是怎么做的呢
条件是怎么样的呢
谢谢啊

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2013-11-06 00:22:41
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lance-tan

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by zqp9110 at 2013-11-06 00:16:27
额,问题貌似还挺多
1.PCR反应各步骤的时间不需要那么长,长时间94℃对聚合酶活性有影响,V3区一共就150多bp,延伸时间30s足够。
2.环境样本用touchdown没错,但总体循环数可少一些,比如20个循环,可减少非特异。 ...

好的,谢谢哈。 我是用的16S全长做的V3扩增的模板,但是没稀释。今天准备稀释下试试。
新手入门求各位大神指导
10楼2013-11-06 13:56:36
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