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lance-tan

金虫 (小有名气)

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专业: 环境微生物学

[求助] 细菌V3区扩增

RT..最近做的细菌V3区扩增想做下DGGE，但是非特异性条带一直很多，退火温度调节了好几次还是没很好的改善。能否请各位看下帮我解决一下
体系如下
2xmix 25ul
338F 1ul
518R 1ul
模板  1ul
ddH2O 补足 50ul  (模板为16S 的产物）
程序
94℃          5 min
94℃          5 min
65℃（-0.5℃）0.5 min 20cycle（第2-4步）
72℃          3 min
94℃          1 min
55℃          0.5min       10cycle（第5-7步）
72℃          3 min
72℃          10min
在下比较着急啊  请各位帮帮忙。。

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新手入门求各位大神指导

1楼2013-11-05 10:18:39

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快乐小托儿

银虫 (小有名气)

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专业: 森林培育学

引用回帖:

8楼: Originally posted by zqp9110 at 2013-11-06 00:16:27
额，问题貌似还挺多
1.PCR反应各步骤的时间不需要那么长，长时间94℃对聚合酶活性有影响，V3区一共就150多bp，延伸时间30s足够。
2.环境样本用touchdown没错，但总体循环数可少一些，比如20个循环，可减少非特异。 ...

请问re-conditioning PCR是怎么做的呢
条件是怎么样的呢
谢谢啊

[ 发自小木虫客户端 ]

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9楼2013-11-06 00:22:41

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