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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 细菌V3区扩增
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lance-tan

金虫 (小有名气)

[求助] 细菌V3区扩增

RT..最近做的细菌V3区扩增想做下DGGE，但是非特异性条带一直很多，退火温度调节了好几次还是没很好的改善。能否请各位看下帮我解决一下
体系如下
2xmix 25ul  
338F 1ul  
518R 1ul
模板  1ul
ddH2O 补足 50ul  (模板为16S 的产物）
程序
94℃             5 min
94℃             5 min
65℃（-0.5℃）0.5 min    20cycle（第2-4步）     
72℃             3 min   
94℃             1 min
55℃            0.5min         10cycle（第5-7步）
72℃             3 min
72℃             10min
在下比较着急啊  请各位帮帮忙。。
细菌V3区扩增
${{RQUFR(I4VCIF]E}Y{U~2.jpg
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新手入门求各位大神指导
1楼 2013-11-05 10:18:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

dllchina

木虫 (著名写手)

有机的微生物大神

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lance-tan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-05 13:11:50
lance-tan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-05 13:12:15
楼主，发个文档给你看看
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  • 附件 1 : 细菌16S_rDNA_V3区的PCR-DGGE分析.doc
    • 2013-11-05 12:30:18, 49 K
4楼2013-11-05 12:30:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zqp9110

金虫 (正式写手)
额，问题貌似还挺多
1.PCR反应各步骤的时间不需要那么长，长时间94℃对聚合酶活性有影响，V3区一共就150多bp，延伸时间30s足够。
2.环境样本用touchdown没错，但总体循环数可少一些，比如20个循环，可减少非特异。
3.建议上DGGE之前做一次re-conditioning PCR，对DGGE效果帮助很大。
4. 貌似你用的是巢式PCR？第一步16S全长的产物作为第二步V3扩增的模板？这样的话模板需要稀释100倍左右，不然量太大，会增加非特异。为何不尝试直接扩增V3区？
赞一下(1人) 回复此楼
BEYOND
8楼2013-11-06 00:16:27
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普通回帖

lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板是提取的什么样品，感觉你第2-4步解链时间有点太长了吧，需要这么久解链嘛
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2楼2013-11-05 10:56:00
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lance-tan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lhf903 at 2013-11-05 10:56:00
模板是提取的什么样品，感觉你第2-4步解链时间有点太长了吧，需要这么久解链嘛

是土壤样品的总DNA,那需要怎么调整呢？
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新手入门求各位大神指导
3楼2013-11-05 12:12:39
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lance-tan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dllchina at 2013-11-05 12:30:20
楼主，发个文档给你看看

谢谢 很有用。。
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新手入门求各位大神指导
5楼2013-11-05 13:12:01
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lhf903

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dllchina at 2013-11-05 12:30:20
楼主，发个文档给你看看

4楼的文档已经讲的差不多了，没什么大问题；我做细菌DGGE是V6区，V3目标条带是200bp，NCBI好像现在不接受200bp以下的序列了吧
赞一下 回复此楼
6楼2013-11-05 21:42:05
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cjlovesen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lhf903 at 2013-11-05 21:42:05
4楼的文档已经讲的差不多了，没什么大问题；我做细菌DGGE是V6区，V3目标条带是200bp，NCBI好像现在不接受200bp以下的序列了吧...

没问题的，还是可以的
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做就做最好的
7楼2013-11-05 22:16:50
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快乐小托儿

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zqp9110 at 2013-11-06 00:16:27
额，问题貌似还挺多
1.PCR反应各步骤的时间不需要那么长，长时间94℃对聚合酶活性有影响，V3区一共就150多bp，延伸时间30s足够。
2.环境样本用touchdown没错，但总体循环数可少一些，比如20个循环，可减少非特异。 ...

请问re-conditioning PCR是怎么做的呢
条件是怎么样的呢
谢谢啊

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2013-11-06 00:22:41
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lance-tan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zqp9110 at 2013-11-06 00:16:27
额，问题貌似还挺多
1.PCR反应各步骤的时间不需要那么长，长时间94℃对聚合酶活性有影响，V3区一共就150多bp，延伸时间30s足够。
2.环境样本用touchdown没错，但总体循环数可少一些，比如20个循环，可减少非特异。 ...

好的，谢谢哈。 我是用的16S全长做的V3扩增的模板，但是没稀释。今天准备稀释下试试。
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新手入门求各位大神指导
10楼2013-11-06 13:56:36
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