[求助] 细菌V3区扩增

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1楼2013-11-05 10:18:39

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dllchina

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附件 1 : 细菌16S_rDNA_V3区的PCR-DGGE分析.doc

2013-11-05 12:30:18, 49 K

4楼2013-11-05 12:30:20

zqp9110

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额，问题貌似还挺多
1.PCR反应各步骤的时间不需要那么长，长时间94℃对聚合酶活性有影响，V3区一共就150多bp，延伸时间30s足够。
2.环境样本用touchdown没错，但总体循环数可少一些，比如20个循环，可减少非特异。
3.建议上DGGE之前做一次re-conditioning PCR，对DGGE效果帮助很大。
4. 貌似你用的是巢式PCR？第一步16S全长的产物作为第二步V3扩增的模板？这样的话模板需要稀释100倍左右，不然量太大，会增加非特异。为何不尝试直接扩增V3区？

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BEYOND

8楼2013-11-06 00:16:27

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lhf903

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【答案】应助回帖

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模板是提取的什么样品，感觉你第2-4步解链时间有点太长了吧，需要这么久解链嘛

2楼2013-11-05 10:56:00

lance-tan

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2楼: Originally posted by lhf903 at 2013-11-05 10:56:00
模板是提取的什么样品，感觉你第2-4步解链时间有点太长了吧，需要这么久解链嘛

是土壤样品的总DNA,那需要怎么调整呢？

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3楼2013-11-05 12:12:39

lance-tan

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4楼: Originally posted by dllchina at 2013-11-05 12:30:20
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谢谢很有用。。

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5楼2013-11-05 13:12:01

lhf903

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4楼: Originally posted by dllchina at 2013-11-05 12:30:20
楼主，发个文档给你看看

4楼的文档已经讲的差不多了，没什么大问题；我做细菌DGGE是V6区，V3目标条带是200bp，NCBI好像现在不接受200bp以下的序列了吧

6楼2013-11-05 21:42:05

cjlovesen

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6楼: Originally posted by lhf903 at 2013-11-05 21:42:05
4楼的文档已经讲的差不多了，没什么大问题；我做细菌DGGE是V6区，V3目标条带是200bp，NCBI好像现在不接受200bp以下的序列了吧...

没问题的，还是可以的

做就做最好的

7楼2013-11-05 22:16:50

快乐小托儿

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8楼: Originally posted by zqp9110 at 2013-11-06 00:16:27
额，问题貌似还挺多
1.PCR反应各步骤的时间不需要那么长，长时间94℃对聚合酶活性有影响，V3区一共就150多bp，延伸时间30s足够。
2.环境样本用touchdown没错，但总体循环数可少一些，比如20个循环，可减少非特异。 ...

请问re-conditioning PCR是怎么做的呢
条件是怎么样的呢
谢谢啊

[ 发自小木虫客户端 ]

9楼2013-11-06 00:22:41

lance-tan

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好的，谢谢哈。我是用的16S全长做的V3扩增的模板，但是没稀释。今天准备稀释下试试。

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10楼2013-11-06 13:56:36