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小果冻524

新虫 (小有名气)

[求助] dgge最后一次分离切胶后用不带GC夹子引物扩增不出目的条带

又来请教大家了。如题还是PCR扩增不出,之前用于做DGGE的pcr用B968F-GC和B1401R效果很好,长度不到500bp,现在切完胶要测序了,用B968F扩不出来了,它与B968F-GC的序列是一样的啊,为什么出不来呢?????
        我试了做引物浓度梯度,模板浓度梯度,退火温度梯度,降落PCR也试过了,都不行,不带GC夹的引物几乎都扩出来了!!
        今天用DNA模板做不带GC夹子引物的扩增也出不来,我就搞不明白了,引物序列是一样的,怎么这就结合不上去了!!
        大家快帮我分析分析吧~~~~或者给我推荐几篇文献也好!跪谢啊!!!!
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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)

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zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖应助 2013-03-29 09:37:24
这个我也遇到过,还有可能就是模板浓度不够。另外你可以做一个二次PCR!

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6楼2013-03-27 17:01:37
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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)

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感谢参与,应助指数 +1
请问你的胶是用什么方法染色的?切下来的胶是怎么处理的呢?这些都比较关键。

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2楼2013-03-27 06:01:18
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小果冻524

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-27 06:01:18
请问你的胶是用什么方法染色的?切下来的胶是怎么处理的呢?这些都比较关键。

gelred染色半小时,切胶后加双蒸水50ul微震荡十来分钟,放冰箱。。
问题是提取的DNA模板也不能用不带GC的引物扩增,只要换引物就残疾
3楼2013-03-27 10:51:23
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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)

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zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖应助 2013-03-29 09:37:18
试一试MIX吧,可能模板中含有酶抑制剂。

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4楼2013-03-27 16:20:21
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小果冻524

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-27 16:20:21
试一试MIX吧,可能模板中含有酶抑制剂。

天根的热启动mix了,如果有抑制剂,怎么带GC的能P出很亮很亮的目的条带呢
5楼2013-03-27 16:39:46
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wubingqi

木虫 (小有名气)

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zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖应助 2013-03-29 09:37:28
小果冻524: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-03-31 21:11:38
用这个引物扩增一下纯菌的dna试试。按这个描述可有可能是引物出现问题了,换新的引物试试。
7楼2013-03-27 18:07:31
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小果冻524

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-27 17:01:37
这个我也遇到过,还有可能就是模板浓度不够。另外你可以做一个二次PCR!

就是用第一次的PCR结果为模板再做一次条件和体系都相同的PCR?这个我试试
8楼2013-03-27 18:23:50
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小果冻524

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by wubingqi at 2013-03-27 18:07:31
用这个引物扩增一下纯菌的dna试试。按这个描述可有可能是引物出现问题了,换新的引物试试。

还没做过纯菌的呢
9楼2013-03-27 18:25:00
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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)

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zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖应助 2013-03-29 09:37:35
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小果冻524 at 2013-03-27 18:23:50
就是用第一次的PCR结果为模板再做一次条件和体系都相同的PCR?这个我试试...

你查查二次PCR的体系吧,网上有,另外,程序的话退火10个就够了!散金啊(*^^*)

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10楼2013-03-27 18:55:30
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