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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » dgge最后一次分离切胶后用不带GC夹子引物扩增不出目的条带
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小果冻524

新虫 (小有名气)

[求助] dgge最后一次分离切胶后用不带GC夹子引物扩增不出目的条带

又来请教大家了。如题还是PCR扩增不出，之前用于做DGGE的pcr用B968F-GC和B1401R效果很好，长度不到500bp，现在切完胶要测序了，用B968F扩不出来了，它与B968F-GC的序列是一样的啊，为什么出不来呢？？？？？
        我试了做引物浓度梯度，模板浓度梯度，退火温度梯度，降落PCR也试过了，都不行，不带GC夹的引物几乎都扩出来了！！
        今天用DNA模板做不带GC夹子引物的扩增也出不来，我就搞不明白了，引物序列是一样的，怎么这就结合不上去了！！
        大家快帮我分析分析吧~~~~或者给我推荐几篇文献也好！跪谢啊！！！！
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1楼 2013-03-26 22:07:24
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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)

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zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖应助 2013-03-29 09:37:24
这个我也遇到过，还有可能就是模板浓度不够。另外你可以做一个二次PCR！

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6楼2013-03-27 17:01:37
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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
请问你的胶是用什么方法染色的？切下来的胶是怎么处理的呢？这些都比较关键。

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2楼2013-03-27 06:01:18
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小果冻524

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-27 06:01:18
请问你的胶是用什么方法染色的？切下来的胶是怎么处理的呢？这些都比较关键。

gelred染色半小时，切胶后加双蒸水50ul微震荡十来分钟，放冰箱。。
问题是提取的DNA模板也不能用不带GC的引物扩增，只要换引物就残疾
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3楼2013-03-27 10:51:23
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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)

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zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖应助 2013-03-29 09:37:18
试一试MIX吧，可能模板中含有酶抑制剂。

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小果冻524
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4楼2013-03-27 16:20:21
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小果冻524

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-27 16:20:21
试一试MIX吧，可能模板中含有酶抑制剂。

天根的热启动mix了，如果有抑制剂，怎么带GC的能P出很亮很亮的目的条带呢
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5楼2013-03-27 16:39:46
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wubingqi

木虫 (小有名气)

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zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖应助 2013-03-29 09:37:28
小果冻524: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-03-31 21:11:38
用这个引物扩增一下纯菌的dna试试。按这个描述可有可能是引物出现问题了，换新的引物试试。
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7楼2013-03-27 18:07:31
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小果冻524

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by taoqi1986918 at 2013-03-27 17:01:37
这个我也遇到过，还有可能就是模板浓度不够。另外你可以做一个二次PCR！

就是用第一次的PCR结果为模板再做一次条件和体系都相同的PCR？这个我试试
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8楼2013-03-27 18:23:50
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小果冻524

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wubingqi at 2013-03-27 18:07:31
用这个引物扩增一下纯菌的dna试试。按这个描述可有可能是引物出现问题了，换新的引物试试。

还没做过纯菌的呢
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9楼2013-03-27 18:25:00
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taoqi1986918

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖应助 2013-03-29 09:37:35
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小果冻524 at 2013-03-27 18:23:50
就是用第一次的PCR结果为模板再做一次条件和体系都相同的PCR？这个我试试...

你查查二次PCR的体系吧，网上有，另外，程序的话退火10个就够了！散金啊(*^^*)

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10楼2013-03-27 18:55:30
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