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liwenwhpu

新虫 (初入文坛)

[求助] 拟南芥pcr图分析

我做的是拟南芥纯和鉴定,每个孔用的引物都是RP和LBb1.3,各0.5ul。我的pcr条带一直不亮,不清楚为什么。前6个孔的样品是同一品种的拟南芥,只是DNA浓度不同,1,3,5的浓度约400ngul,2,4,6的浓度约为1100ng/ul。我这次是想看dNTP浓度多少合适,所以第1,2孔的dNTP是0.5ul,3,4孔的是1.0ul,5,6孔的是1.5ul。第7孔加的是col,dNTP 1ul。体系是25ul,10×buffer 2.5ul,pfu酶:0.1ul,模板1ul,水 21ul,引物共1ul。pcr:94℃:3min;94℃:30s,56℃:30s,72℃:1min,30个循环;72℃:5min;16℃:5min.请大侠解答为什么我的条带不亮,是引物加多了吗?但是1,3,5孔没有形成引物二聚体的为什么条带也不亮?
拟南芥pcr图分析
2013.9.20.gif
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liwenwhpu

新虫 (初入文坛)

?没人回答?
2楼2013-09-21 18:01:54
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匿名

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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-09-21 22:24:55
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3楼2013-09-21 19:10:49
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匿名

用户注销 (著名写手)

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-21 22:24:59
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4楼2013-09-21 19:13:46
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liwenwhpu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 彬心玉壶 at 2013-09-21 19:10:49
温馨提示:
1、如果你是“拟南芥纯和鉴定”,先搞定出一点,你的重点是鉴定,带亮不亮不重要,重要的是有没有目的带?这就够了。(如果想在最终确定的话,切胶送测序就好了)。你不是做什么PCR检测试剂盒,我个人觉 ...

首先谢谢你的回答。2,4,6的亮度应该是引物的,我的目标片段的900bp左右。marker在我这边看还可以,应该是照片没调好,凝胶成像仪不是特别清楚。用pfu酶的是因为实验室一直都是用这个酶,不过我下午可以试一试用taq酶。
5楼2013-09-22 12:13:24
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