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emingju

银虫 (小有名气)

[求助] PCR困惑求助！非常急！

我之前的这对引物PCR效果非常好，后来不知道什么原因pcr后成这样子了，模板肯定没问题。因为PCR其他的引物都很好，引物也重新合成过，还是不行，大家帮出出主意，什么条件调整一下会好呢？我这个是做SSR扫版的。现在这对引物已经测出一大部分，现在剩余的P不出来，很急很急！
PCR困惑求助！非常急！
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1楼 2013-09-20 12:19:40
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-09-20 19:59:43
PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策

2013年8月23日总结（第二次修订，加上序号，使文章的层次清晰，另外修正了错漏之处）
     
    PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
    其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

    其对策有：
  1.减少酶量（一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点，分梯度上下调一调，其他酶也差不多如此浓度，可以参考说明书）；加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。
  2. 增加DNA聚合酶的专一性。
（1）改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。   
（2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起酶的浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。
（3）为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。 的专一性，可在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。
3.适当减少dNTP的浓度；减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓度同方向偶联进行，但是不必按同样的比例。
4.适当降低Mg2+浓 度，可以采用梯度递减方式，以每次0.5mol/L递减，但是Mg2+的终浓度不要低于1.0mol/L。
5. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。
6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
7.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。
8. 保证PCR反应的DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。
9.以上措施都不行时，最后就只能重新设计引物，加强引物的专一性。
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2楼2013-09-20 12:37:35
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清雅风

木虫 (著名写手)
试试延长延伸的时间
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朝着自己的理想奔跑，就是幸福！
3楼2013-09-20 12:43:23
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emingju

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-20 12:37:35
PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策

2013年8月23日总结（第二次修订，加上序号，使文章的层次清晰，另外修正了错漏之处）
     
    PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
    其原因往 ...

我试试，非常感谢1
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4楼2013-09-22 12:57:28
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emingju

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 清雅风 at 2013-09-20 12:43:23
试试延长延伸的时间

好的，我试试，非常感谢！
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5楼2013-09-22 12:57:52
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15879003030

铜虫 (小有名气)
感觉2楼这段回复就是存在电脑里随时复制粘贴的，谁都知道的东西，毫不实用。
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6楼2013-09-22 17:02:14
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zq347597638

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果像楼主说的 你以前用同一个程序 相同的引物，该模板P出来过，现在P成这样
真的有可能是模板的问题，可能是降解了
因为我做PCR，经常也出现这样的情况，前面都能P出来，后来P出来的样子很像你这个图，我就立刻换模板，又跟以前一样了！
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7楼2013-09-23 09:20:16
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