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冯可

新虫 (初入文坛)


[交流] SYBR 荧光定量PCR 阴性对照问题

反应条件:
98℃ 2min
40循环
98℃ 30s
53.6℃ 30s
72℃ 30s
72℃  7min
反应体系:
MightAmp mix (takara ) 10μL
引物(2μM)             1μL
引物(2μM)             1μL
模板                     2μL
水                       6μL
                                          20μL体系
问题:
1.前辈们看看 我这个图,无模板对照和阴性对照都出现扩增是不是不行啊?怎么去除呢?引物浓度调节我试过了,降低引物浓度是,阴性对照也会随之消失,但是却应先检出限。 将循环数减少至30个循环,阴性扩增会消失,但是不知道可不可性,同时还是影响检出限。 我在考虑增大退火温度是否可行呢?
求大家指点。郁闷啊 ~~~ 小弟刚入手。

图标说明结果说明:
孔        荧光基团        样本类型                   Cq        解链温度 1
A01-Ch5        SYBR        阳性对照          13.04        80.19
A02-Ch5        SYBR        阳性对照           13.17        80.13
A03-Ch5        SYBR        阳性对照           12.92        79.97
A04-Ch5        SYBR        阳性对照                 17.81        80
C03-Ch5        SYBR        阳性对照                 18.05        80.01
C01-Ch5        SYBR        无模板对照        32.32        80.17
C02-Ch5        SYBR        无模板对照        32.37        80.04
C05-Ch5        SYBR        阴性对照                 32.68        79.93
C06-Ch5        SYBR        阴性对照                  33.09        79.86
SYBR 荧光定量PCR 阴性对照问题
1.png


SYBR 荧光定量PCR 阴性对照问题-1
2.png
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86964109

木虫 (小有名气)


★ ★
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laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励交流! 2013-09-13 17:14:19
你这个是不是存在气溶胶污染啊
2楼2013-09-13 08:16:53
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shwjs88

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
以前碰到过,跑到别的楼上借了点水,高压后再用,解决了。就是污染

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2013-09-14 13:34:20
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cxfans

铁杆木虫 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
不用担心 我用的引物一直都有这样的问题。理论上说ct在33以上算是超出检测灵敏度范围的不可信数据。而且我每次ntc都有这样的现象,很难做到不出扩增的阴性对照。有说法是在加模板时换到另外一个房间(有条件的可以单批出一个房间做定量),但我没试过
4楼2013-09-15 10:26:35
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sfj311

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我做的也是这样,阴性很不稳定,至今还没找到答案
5楼2014-09-15 10:56:34
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吕木木

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
怎么做阴性对照啊,急死了

发自小木虫Android客户端
6楼2016-01-25 01:27:00
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吕木木

新虫 (小有名气)


错了,是怎么做阳性对照啊

发自小木虫Android客户端
7楼2016-01-25 01:27:52
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kx361

金虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
气溶胶污染,之前我也遇见过,注意加试剂和加模板移液枪分开,两个房间加样,用过的垃圾缸及时清理,加样顺序,先试剂,后阴性对照,先样品,加完后盖上盖子在加阳性模板,具体情况,具体对待。我一般40个循环,阴性对照没有值

发自小木虫Android客户端
8楼2016-01-25 05:53:05
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