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酶切连接 （难题一个接一个呀）
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| 我在做Sac1和Xho1的双酶切连接（这两个酶切位点应该没啥问题吧 ？），分别用这两个酶对表达载体和T载体进行双酶切过夜（NEB的酶 标注说过夜不会产生星活性），T载体上我还加了保护碱基，然后分别切胶回收表达载体的大片段和T载体上的目的片段（两个片段都很亮，大小也合适，大片段约16k，目的片段1100bp）,大片段浓度是150纳克/微升，小片段是33纳克/微升，然后做连接（连接是用的NEB的普通连接酶，16度16小时），共20微升体系（1微升连接酶，连接酶我用的是新的;2微升10×连接buffer，也换过新的; 共做了三个比例即大片段与目的片段两者的摩尔比是1:6 1:10 和1:15），再进行热击转化涂皿，分别做了阳性对照（很多单菌落）和阴性对照（无单菌落）可以证明感受态及转化过程没问题，双酶切也成功。可为什么我的连接反应却一个单菌落也长不出来呢（抗性和浓度也没问题），哪位高人帮帮忙？？？最近快烦死了。。。。。 |
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 核酸生物学实验经验 |
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太巧了，我正好也在用这两个酶做双酶切连接。 前面有人提到的解决方法是对的：载体酶切处理后一定要脱磷处理，因为SacI和XhoI是同尾酶，产生相同的粘性末端！ 但是，这个说法不是解决楼主问题的首要方法，看楼主的描述是连接产物转化产生不了任何单菌落，这问题就大了。 我的疑点，仅供参考： 1. 我很怀疑你的载体是不是有问题，可以分别用SacI和XhoI对载体进行单酶切处理，然后加上不酶切的载体做对照，看看你的载体是否真的能被切开，如果不能被切开，说明有两个可能，一是载体错了，二是载体上酶切位点不好用了； 2. 你说你做了阳性对照，阳性对照是什么呢？有没有做这样一个必要的对照：用空载体同步转化，它在平皿上能正常生长。如果不能，也说明你的载体是错误的，这能很好解释为什么你的连接转化产物什么都不长； 3. 再有一点是，前面大家有人提到SacI和XhoI是同尾酶，如果你的载体没有脱磷处理，理论上上会产生大量的自连，那么在你的转化涂板的平皿上应该看到很多菌落才对。你看不到，也说明你的载体很可能是错误的； 4. 抗性问题，楼主自己已经注意了，我就不多说了。 祝好! |
8楼2013-09-02 17:20:33
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转化后没有克隆长出，说明载体已经全切开，转化的阴性对照也没问题话，可能是连接的问题，或者片段没切好 以下几点注意一下 1、NEB SacI、XhoI的建议buffer：Digest in CutSmart™ Buffer at 37°C. 2、时间的话NEB2-3h即可，时间太长不好，回切乱 3、片段是否设有保护碱基？ 4、可以再少加点载体，多加些片段进去 再试一次，应该能成功 |
9楼2013-09-02 19:13:47
10楼2013-09-02 19:19:06
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