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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切连接 （难题一个接一个呀）
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33ggdf

新虫 (小有名气)

[求助] 酶切连接 （难题一个接一个呀）

我在做Sac1和Xho1的双酶切连接（这两个酶切位点应该没啥问题吧 ？），分别用这两个酶对表达载体和T载体进行双酶切过夜（NEB的酶 标注说过夜不会产生星活性），T载体上我还加了保护碱基，然后分别切胶回收表达载体的大片段和T载体上的目的片段（两个片段都很亮，大小也合适，大片段约16k，目的片段1100bp）,大片段浓度是150纳克/微升，小片段是33纳克/微升，然后做连接（连接是用的NEB的普通连接酶，16度16小时），共20微升体系（1微升连接酶，连接酶我用的是新的;2微升10×连接buffer，也换过新的; 共做了三个比例即大片段与目的片段两者的摩尔比是1:6  1:10   和1:15），再进行热击转化涂皿，分别做了阳性对照（很多单菌落）和阴性对照（无单菌落）可以证明感受态及转化过程没问题，双酶切也成功。可为什么我的连接反应却一个单菌落也长不出来呢（抗性和浓度也没问题），哪位高人帮帮忙？？？最近快烦死了。。。。。
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1楼2013-08-31 16:05:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

eulota

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
33ggdf: 金币+2 2013-09-02 19:16:27
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-09-04 16:34:48
gyesang: 回帖置顶 2013-09-04 21:51:51
太巧了，我正好也在用这两个酶做双酶切连接。
前面有人提到的解决方法是对的：载体酶切处理后一定要脱磷处理，因为SacI和XhoI是同尾酶，产生相同的粘性末端！

但是，这个说法不是解决楼主问题的首要方法，看楼主的描述是连接产物转化产生不了任何单菌落，这问题就大了。
我的疑点，仅供参考：
1. 我很怀疑你的载体是不是有问题，可以分别用SacI和XhoI对载体进行单酶切处理，然后加上不酶切的载体做对照，看看你的载体是否真的能被切开，如果不能被切开，说明有两个可能，一是载体错了，二是载体上酶切位点不好用了；
2. 你说你做了阳性对照，阳性对照是什么呢？有没有做这样一个必要的对照：用空载体同步转化，它在平皿上能正常生长。如果不能，也说明你的载体是错误的，这能很好解释为什么你的连接转化产物什么都不长；
3. 再有一点是，前面大家有人提到SacI和XhoI是同尾酶，如果你的载体没有脱磷处理，理论上上会产生大量的自连，那么在你的转化涂板的平皿上应该看到很多菌落才对。你看不到，也说明你的载体很可能是错误的；
4. 抗性问题，楼主自己已经注意了，我就不多说了。

祝好!
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8楼2013-09-02 17:20:33
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cr507

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
33ggdf: 金币+1 2013-09-02 08:16:45
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-04 16:34:57
首先用这两个酶做双酶切是不合适的，它们产生相同的粘性末端，跟单酶切没什么分别，理论上会导致大量的载体自连。另外建议楼主缩短酶切时间试试，NEB的酶按说明书的体系切2小时就足够了。其他应该没什么问题，祝好运！
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3楼2013-09-01 21:22:30
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eulota

金虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 33ggdf at 2013-09-02 19:19:06
首先 谢谢你的耐心解答、
其实我不认为这是同尾酶，因为这两个酶的酶切位点不一样，方向是反的，我不明白为什么你们说它们是同尾酶？
你是怎么连接的呢？成功了吗 ？
我觉得咱们可以互相交流一下心得 相互学习...

你好。
你说的没错，他们的酶切位点不一样，但是切出来的粘性末端是一样的啊（尾巴一样--同尾），所以载体用着两个酶处理后连接时会导致很自然的自连。
我还在构建中~~
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11楼2013-09-04 15:20:30
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因为吃饭

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-09-04 16:35:37
载体自连的话那应该会长菌才对，但是楼主没长啊。
我最近也做转化，13k的载体和1400bp的片段，试了很多连接方法，也做了各种对照，takara的、neb的酶都试过了，连过夜，快连，还用重组酶，也总是没有菌。
现在做了3个星期了，上一批的终于长了3个出来了，今天做菌p。希望能有阳性。
说了这么多，就是多做，如果其他没问题，总会做出来的。另外实验的一些小细节要多注意，因为这么大的载体做转化，效率本来就很低，要是细节不注意的话，就很难长出来了。
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辩证。
12楼2013-09-04 16:00:48
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普通回帖

suhsia

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-08-31 18:20:44
33ggdf: 金币+1 2013-09-02 08:16:37
换个人做一下就行了，克隆这东西手气很重要，没设么技术含量的

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2013-08-31 16:23:24
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ykluuniu

金虫 (小有名气)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-04 16:35:18
gyesang: 回帖置顶 2013-09-04 21:52:20
引用回帖:
3楼: Originally posted by cr507 at 2013-09-01 21:22:30
首先用这两个酶做双酶切是不合适的，它们产生相同的粘性末端，跟单酶切没什么分别，理论上会导致大量的载体自连。另外建议楼主缩短酶切时间试试，NEB的酶按说明书的体系切2小时就足够了。其他应该没什么问题，祝好运 ...

不同的酶，切出来的是不同的粘性末端，为什么和单酶切没有区别呢？你说的显然是不对的。
载体自连可能是因为双酶切过程中，有一个酶酶切不彻底的缘故。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2013-09-01 22:46:12
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suhsia

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-04 21:52:31
引用回帖:
4楼: Originally posted by ykluuniu at 2013-09-01 22:46:12
不同的酶，切出来的是不同的粘性末端，为什么和单酶切没有区别呢？你说的显然是不对的。
载体自连可能是因为双酶切过程中，有一个酶酶切不彻底的缘故。
...

那其实不如就做单酶切，然后去磷酸化，那样只要是长出来的克隆就有二分之一是阳性克隆，我做过，很方便

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2013-09-02 10:13:31
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514278815

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-04 21:52:42
三楼说的还是有道理的，酶切位点你再仔细看看有问题没？至于说是载体自连也不大可能吧，自连也会长出菌落呀。二楼说的换个人做一下到可以试一试的。
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6楼2013-09-02 10:23:10
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ykluuniu

金虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-04 21:52:51
引用回帖:
5楼: Originally posted by suhsia at 2013-09-02 10:13:31
那其实不如就做单酶切，然后去磷酸化，那样只要是长出来的克隆就有二分之一是阳性克隆，我做过，很方便
...

酶切连接不是靠运气，基本操作必须过关，但是连接的过程就是一个概率事件，所以在连接体系中，我们才设计一个比较合适的载体与目的片段的摩尔比。
过程只是有点枯燥，但是不难，没有必要搞的那么难吧。
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7楼2013-09-02 17:04:20
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yan.007133

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-04 16:35:25
33ggdf: 金币+2 2013-09-06 14:50:59
转化后没有克隆长出，说明载体已经全切开，转化的阴性对照也没问题话，可能是连接的问题，或者片段没切好
以下几点注意一下
1、NEB SacI、XhoI的建议buffer：Digest in CutSmart™ Buffer at 37°C.
2、时间的话NEB2-3h即可，时间太长不好，回切乱
3、片段是否设有保护碱基？
4、可以再少加点载体，多加些片段进去
再试一次，应该能成功
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9楼2013-09-02 19:13:47
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33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by eulota at 2013-09-02 17:20:33
太巧了，我正好也在用这两个酶做双酶切连接。
前面有人提到的解决方法是对的：载体酶切处理后一定要脱磷处理，因为SacI和XhoI是同尾酶，产生相同的粘性末端！

但是，这个说法不是解决楼主问题的首要方法，看楼主 ...

首先 谢谢你的耐心解答、
其实我不认为这是同尾酶，因为这两个酶的酶切位点不一样，方向是反的，我不明白为什么你们说它们是同尾酶？
你是怎么连接的呢？成功了吗 ？
我觉得咱们可以互相交流一下心得 相互学习
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10楼2013-09-02 19:19:06
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