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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切连接 （难题一个接一个呀）
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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33ggdf

新虫 (小有名气)

[求助] 酶切连接 （难题一个接一个呀）

我在做Sac1和Xho1的双酶切连接（这两个酶切位点应该没啥问题吧 ？），分别用这两个酶对表达载体和T载体进行双酶切过夜（NEB的酶 标注说过夜不会产生星活性），T载体上我还加了保护碱基，然后分别切胶回收表达载体的大片段和T载体上的目的片段（两个片段都很亮，大小也合适，大片段约16k，目的片段1100bp）,大片段浓度是150纳克/微升，小片段是33纳克/微升，然后做连接（连接是用的NEB的普通连接酶，16度16小时），共20微升体系（1微升连接酶，连接酶我用的是新的;2微升10×连接buffer，也换过新的; 共做了三个比例即大片段与目的片段两者的摩尔比是1:6  1:10   和1:15），再进行热击转化涂皿，分别做了阳性对照（很多单菌落）和阴性对照（无单菌落）可以证明感受态及转化过程没问题，双酶切也成功。可为什么我的连接反应却一个单菌落也长不出来呢（抗性和浓度也没问题），哪位高人帮帮忙？？？最近快烦死了。。。。。
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1楼 2013-08-31 16:05:27
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因为吃饭

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-09-04 16:35:37
载体自连的话那应该会长菌才对，但是楼主没长啊。
我最近也做转化，13k的载体和1400bp的片段，试了很多连接方法，也做了各种对照，takara的、neb的酶都试过了，连过夜，快连，还用重组酶，也总是没有菌。
现在做了3个星期了，上一批的终于长了3个出来了，今天做菌p。希望能有阳性。
说了这么多，就是多做，如果其他没问题，总会做出来的。另外实验的一些小细节要多注意，因为这么大的载体做转化，效率本来就很低，要是细节不注意的话，就很难长出来了。
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辩证。
12楼2013-09-04 16:00:48
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suhsia

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-08-31 18:20:44
33ggdf: 金币+1 2013-09-02 08:16:37
换个人做一下就行了，克隆这东西手气很重要，没设么技术含量的

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2013-08-31 16:23:24
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cr507

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
33ggdf: 金币+1 2013-09-02 08:16:45
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-04 16:34:57
首先用这两个酶做双酶切是不合适的，它们产生相同的粘性末端，跟单酶切没什么分别，理论上会导致大量的载体自连。另外建议楼主缩短酶切时间试试，NEB的酶按说明书的体系切2小时就足够了。其他应该没什么问题，祝好运！
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3楼2013-09-01 21:22:30
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ykluuniu

金虫 (小有名气)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-04 16:35:18
gyesang: 回帖置顶 2013-09-04 21:52:20
引用回帖:
3楼: Originally posted by cr507 at 2013-09-01 21:22:30
首先用这两个酶做双酶切是不合适的，它们产生相同的粘性末端，跟单酶切没什么分别，理论上会导致大量的载体自连。另外建议楼主缩短酶切时间试试，NEB的酶按说明书的体系切2小时就足够了。其他应该没什么问题，祝好运 ...

不同的酶，切出来的是不同的粘性末端，为什么和单酶切没有区别呢？你说的显然是不对的。
载体自连可能是因为双酶切过程中，有一个酶酶切不彻底的缘故。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2013-09-01 22:46:12
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