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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切连接 （难题一个接一个呀）
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eulota

金虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 33ggdf at 2013-09-02 19:19:06
首先 谢谢你的耐心解答、
其实我不认为这是同尾酶，因为这两个酶的酶切位点不一样，方向是反的，我不明白为什么你们说它们是同尾酶？
你是怎么连接的呢？成功了吗 ？
我觉得咱们可以互相交流一下心得 相互学习...

你好。
你说的没错，他们的酶切位点不一样，但是切出来的粘性末端是一样的啊（尾巴一样--同尾），所以载体用着两个酶处理后连接时会导致很自然的自连。
我还在构建中~~
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11楼2013-09-04 15:20:30
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因为吃饭

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-09-04 16:35:37
载体自连的话那应该会长菌才对，但是楼主没长啊。
我最近也做转化，13k的载体和1400bp的片段，试了很多连接方法，也做了各种对照，takara的、neb的酶都试过了，连过夜，快连，还用重组酶，也总是没有菌。
现在做了3个星期了，上一批的终于长了3个出来了，今天做菌p。希望能有阳性。
说了这么多，就是多做，如果其他没问题，总会做出来的。另外实验的一些小细节要多注意，因为这么大的载体做转化，效率本来就很低，要是细节不注意的话，就很难长出来了。
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辩证。
12楼2013-09-04 16:00:48
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忽而今秋

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
33ggdf: 金币+2 2013-09-05 10:19:33
胶回收有没有打长波？载体酶切后有没有处理后再走胶。

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13楼2013-09-05 00:31:45
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33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 忽而今秋 at 2013-09-05 00:31:45
胶回收有没有打长波？载体酶切后有没有处理后再走胶。

打长波 是什么意思？你说的这个处理指的是酶失活吗？酶进行了失活的！
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14楼2013-09-05 10:20:59
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忽而今秋

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 33ggdf at 2013-09-05 10:20:59
打长波 是什么意思？你说的这个处理指的是酶失活吗？酶进行了失活的！...

胶回收时在紫外下操作的，这个紫外是长波，否则DNA会被损伤。载体走胶前要要用CIAP处理十五分钟。

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15楼2013-09-05 12:14:05
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say你好

新虫 (初入文坛)
想问一下楼主，载体与目的片段的连接比例不应该是3~7倍关系吗？怎么还可以有1：15的情况，还有，楼主的阳性对照和阴性对照分别指的是什么，能给我说说妈

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16楼2017-07-03 20:23:42
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say你好

新虫 (初入文坛)
好吧，没说完，阳性对照和阴性对照分别是什么，能讲一下吗？我们最近在跟着老师做分子，今晚做的转化，之前也做过几次，但每次都没有菌落生成，怕明天还是出不来菌落，哎，

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17楼2017-07-03 20:26:08
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say你好

新虫 (初入文坛)
还有，加了阳性对照，阴性对照之后为什么就能确定酶切的没有问题啊，想了解一下，谢谢楼主

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18楼2017-07-03 20:27:26
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