应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切连接 （难题一个接一个呀）
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
52/1返回列表
查看: 3281  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

33ggdf

新虫 (小有名气)

[求助] 酶切连接 （难题一个接一个呀）

我在做Sac1和Xho1的双酶切连接（这两个酶切位点应该没啥问题吧 ？），分别用这两个酶对表达载体和T载体进行双酶切过夜（NEB的酶 标注说过夜不会产生星活性），T载体上我还加了保护碱基，然后分别切胶回收表达载体的大片段和T载体上的目的片段（两个片段都很亮，大小也合适，大片段约16k，目的片段1100bp）,大片段浓度是150纳克/微升，小片段是33纳克/微升，然后做连接（连接是用的NEB的普通连接酶，16度16小时），共20微升体系（1微升连接酶，连接酶我用的是新的;2微升10×连接buffer，也换过新的; 共做了三个比例即大片段与目的片段两者的摩尔比是1:6  1:10   和1:15），再进行热击转化涂皿，分别做了阳性对照（很多单菌落）和阴性对照（无单菌落）可以证明感受态及转化过程没问题，双酶切也成功。可为什么我的连接反应却一个单菌落也长不出来呢（抗性和浓度也没问题），哪位高人帮帮忙？？？最近快烦死了。。。。。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2013-08-31 16:05:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

33ggdf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 忽而今秋 at 2013-09-05 00:31:45
胶回收有没有打长波？载体酶切后有没有处理后再走胶。

打长波 是什么意思？你说的这个处理指的是酶失活吗？酶进行了失活的！
赞一下 回复此楼
14楼2013-09-05 10:20:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答

suhsia

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-08-31 18:20:44
33ggdf: 金币+1 2013-09-02 08:16:37
换个人做一下就行了，克隆这东西手气很重要，没设么技术含量的

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
2楼2013-08-31 16:23:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cr507

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
33ggdf: 金币+1 2013-09-02 08:16:45
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-04 16:34:57
首先用这两个酶做双酶切是不合适的，它们产生相同的粘性末端，跟单酶切没什么分别，理论上会导致大量的载体自连。另外建议楼主缩短酶切时间试试，NEB的酶按说明书的体系切2小时就足够了。其他应该没什么问题，祝好运！
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2013-09-01 21:22:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ykluuniu

金虫 (小有名气)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-04 16:35:18
gyesang: 回帖置顶 2013-09-04 21:52:20
引用回帖:
3楼: Originally posted by cr507 at 2013-09-01 21:22:30
首先用这两个酶做双酶切是不合适的，它们产生相同的粘性末端，跟单酶切没什么分别，理论上会导致大量的载体自连。另外建议楼主缩短酶切时间试试，NEB的酶按说明书的体系切2小时就足够了。其他应该没什么问题，祝好运 ...

不同的酶，切出来的是不同的粘性末端，为什么和单酶切没有区别呢？你说的显然是不对的。
载体自连可能是因为双酶切过程中，有一个酶酶切不彻底的缘故。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
4楼2013-09-01 22:46:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0703化学321分求调剂 +5 三dd. 2026-03-30 6/300 2026-03-30 15:07 by sophie2180
[基金申请] 面上5B能上会吗？ +7 redcom 2026-03-29 7/350 2026-03-30 12:44 by 爱搞研究的小孩
[考研] 0703化学/290求调剂/本科经历丰富/工科也可 +13 丹青奶盖 2026-03-26 15/750 2026-03-30 12:35 by fangnagu
[考研] 297求调剂 +13 田洪有 2026-03-26 13/650 2026-03-30 11:33 by 替代品000
[考研] 334分 一志愿武理 材料求调剂 +12 李李不服输 2026-03-26 12/600 2026-03-30 10:33 by 我是小康
[考研] 311求调剂 +10 lin0039 2026-03-26 10/500 2026-03-30 10:26 by herarysara
[考研] 375求调剂 +6 雨夏整夜 2026-03-29 6/300 2026-03-30 10:21 by herarysara
[考研] 085600，材料与化工321分求调剂 +10 大馋小子 2026-03-28 10/500 2026-03-29 23:35 by 飞行日记西
[考研] 291求调剂 +5 Y-cap 2026-03-29 6/300 2026-03-29 13:18 by mumin1990
[考研] 一志愿郑州大学，080500学硕，总分317分求调剂 +8 举个栗子oi 2026-03-24 9/450 2026-03-29 13:08 by peike
[考研] 086000生物与医药调剂 +5 Feisty。 2026-03-28 9/450 2026-03-29 12:02 by longlotian
[考研] 311（085601）求调剂 +4 liziyeyeye 2026-03-28 4/200 2026-03-28 18:50 by 535743368
[考研] 压国家一区线，求导师收留，有恩必谢！ +7 迷人的哈哈 2026-03-28 7/350 2026-03-28 16:47 by 催化大白
[考研] 286求调剂 +12 PolarBear11 2026-03-26 12/600 2026-03-28 12:14 by zllcz
[考研] 286求调剂 +4 丢掉懒惰 2026-03-27 7/350 2026-03-28 08:07 by baoball
[考研] 275求调剂 +10 jjjjjjjjjjl 2026-03-27 10/500 2026-03-27 23:47 by barnett0632
[考研] 一志愿吉大071010，316分求调剂 +3 xgbiknn 2026-03-27 3/150 2026-03-27 10:36 by guoweigw
[考研] 341求调剂 +7 青柠檬1 2026-03-26 7/350 2026-03-27 00:19 by wxiongid
[考研] 打过很多竞赛，085406控制工程300分，求调剂 +3 askeladz 2026-03-26 3/150 2026-03-26 09:08 by 给你你注意休息
[考研] 求调剂 +3 李李不服输 2026-03-25 3/150 2026-03-25 13:03 by cmz0325
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭