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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR 结果出来 内参和目的基因的ct 都相差不大 可能原因有哪些？
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新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR 结果出来 内参和目的基因的ct 都相差不大 可能原因有哪些？

第一：抽提了几次RNA, 结果都是这样，理论上 内参CT应该比目的CT 少,至少两个循环吧？
第二:我抽提的RNA 测浓度为359.9ng/微升,A260/A280为2.08，这结果应该表明我抽提的RNA 没怎么降解 和DNA污染吧？
第三： 我用了TAKALA 的PrimeScritpt RT reagent Kit writh gDNA Eraser 的反转录试剂盒，加入Total RNA 量是1/0.3599=2.778微升的RNA抽提液，使其终浓度为1ng/ul,(符合试剂盒要求的：20ul反转录反应体系中，SYBR染色PCR法最多可使用1ug的Total RNA)   这一步也没错的话，那应该说我抽提的RNA 没什么问题吧？
最后结果是：为什么定量结果如题目所说的那样的呢？
  另外荧光出来的扩增曲线 都是单峰
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1楼 2013-08-25 14:54:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
反转录时是否做了负对照？虽然样品RNA的A260/280不错，不能说明没有痕量gDNA的残余，应该在反转录时做负对照样品，荧光定量时检测有没有扩增。
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2楼2013-08-25 23:32:54
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momo12345678

新虫 (小有名气)
1.看你选的内参是什么基因，某些内参基因的表达就是很接近目的基因，ct值会很接近，这个问题不大。
2. 如果你怀疑RNA有降解的，在测完吸光值可以取些进行普通PCR，跑胶看看；
3. 我们之前用的也是20ul体系加 1ul
3. 扩增曲线是单峰的，不是说明没有非特异性的扩增了吗？如果不是很确定，可以将RT产物跑电泳看看扩增条带的情况。
以上纯属愚见。
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3楼2014-07-04 16:31:15
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