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新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR 结果出来 内参和目的基因的ct 都相差不大 可能原因有哪些?

第一:抽提了几次RNA, 结果都是这样,理论上 内参CT应该比目的CT 少,至少两个循环吧?
第二:我抽提的RNA 测浓度为359.9ng/微升,A260/A280为2.08,这结果应该表明我抽提的RNA 没怎么降解 和DNA污染吧?
第三: 我用了TAKALA 的PrimeScritpt RT reagent Kit writh gDNA Eraser 的反转录试剂盒,加入Total RNA 量是1/0.3599=2.778微升的RNA抽提液,使其终浓度为1ng/ul,(符合试剂盒要求的:20ul反转录反应体系中,SYBR染色PCR法最多可使用1ug的Total RNA)   这一步也没错的话,那应该说我抽提的RNA 没什么问题吧?
最后结果是:为什么定量结果如题目所说的那样的呢?
  另外荧光出来的扩增曲线 都是单峰
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
反转录时是否做了负对照?虽然样品RNA的A260/280不错,不能说明没有痕量gDNA的残余,应该在反转录时做负对照样品,荧光定量时检测有没有扩增。
2楼2013-08-25 23:32:54
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momo12345678

新虫 (小有名气)

1.看你选的内参是什么基因,某些内参基因的表达就是很接近目的基因,ct值会很接近,这个问题不大。
2. 如果你怀疑RNA有降解的,在测完吸光值可以取些进行普通PCR,跑胶看看;
3. 我们之前用的也是20ul体系加 1ul
3. 扩增曲线是单峰的,不是说明没有非特异性的扩增了吗?如果不是很确定,可以将RT产物跑电泳看看扩增条带的情况。
以上纯属愚见。
3楼2014-07-04 16:31:15
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